目的 探讨富马酸二甲酯(DMF)对过氧化氢(H2O2)诱导人心脏微血管内皮细胞(HCMEC)铁死亡的影响及其机制.方法 体外培养血管内皮细胞,使用H2O2处理内皮细胞,并用不同浓度DMF干预内皮细胞,采用CCK-8法测细胞增殖;ELISA法检测细胞炎症水平;Western blot检测铁死亡蛋白GPX4和ACSL4,以及Nrf2/HO-1和JAK2/STAT1通路蛋白的改变.结果 CCK8实验结果表明,与对照组相比,H2O2可诱导HCMEC增殖能力下降,而DMF成浓度依赖性促进HCMEC增殖(P<0.05).H2O2诱导的HCMEC细胞炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-18水平增加,DMF处理能抑制上述炎症因子的水平(P<0.05).Western blot结果显示,H2O2处理引起细胞内GPX4蛋白下降,而ACSL4蛋白升高;DMF能抑制H2O2诱导的HCMEC细胞铁死亡(P<0.05).H2O2可诱导HCMEC中Nrf2和HO-1蛋白表达下降,而JAK2和STAT1的磷酸化水平的增加(P<0.05);同H2O2组比,DMF可增加Nrf2和HO-1蛋白,并下调JAK2和STAT1的磷酸化水平(P<0.05).使用Nrf2抑制剂ML385干预细胞,发现其可明显减弱DMF对细胞铁死亡的抑制和HCMEC损伤的保护作用.结论 DMF能抑制H2O2诱导的HCMEC炎症和铁死亡.Nrf2/HO-1和JAK2/STAT1通路可能在DMF介导的HCMEC保护作用中起到关键作用.

目的:研究Bcl-2、Bax基因在缺血再灌注损伤人心脏微血管内皮细胞(HCMEC)凋亡通路中的作用,及黄芪多糖的干预作用.方法:培养原代HCMEC,通过缺氧再复氧刺激细胞损伤,并用黄芪多糖进行干预.采用Western blot、PCR等方法检测Bcl-2、Bax.结果:与正常组比较,损伤组Bax表达增强,Bcl-2表达减弱,Bcl-2/Bax降低(P＜0.05).与损伤组比较,中、高浓度组Bcl-2表达上调(P＜0.05),Bcl-2/Bax值升高(P＜0.05),各浓度组Bax均降低(P＜0.05).结论:Bcl-2、Bax在介导缺血再灌注损伤HCMEC凋亡通路中起重要作用,黄芪多糖通过上调Bcl-2的表达、抑制Bax的升高以及提高Bcl-2/Bax的比值,对缺血再灌注损伤HCMEC凋亡具有一定的保护作用.

目的 观察人心肌细胞在缺血再灌注损伤过程中蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)又称Akt,与细胞外信号调节激酶1/2(extracellar signal-regulated kiase,ERK1/2)的表达规律及其与细胞凋亡的关系,以探索黄芪多糖产生心肌保护作用的机制.方法 培养原代人心脏微血管内皮细胞(human cardiac microvascular endothelial cells,HCMEC),通过缺氧再复氧刺激细胞损伤,模拟缺血再灌注损伤的实验技术平台,建立缺血再灌注损伤模型,继而采用黄芪多糖进行干预,随机分为:HCMEC正常对照组(对照组)、HCMEC损伤组(损伤组)、HCMEC损伤组+低浓度的药物(低药物组)、HCMEC损伤组+中浓度的药物(中药物组)、HCMEC损伤组+高浓度的药物(高药物组),进而采用Western Blot方法检测ERK、p-ERK、Akt蛋白表达情况,采用流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡情况.结果 从流式细胞仪结果显示:对照组为5.43%;损伤组细胞凋亡程度增高最明显,为92.88%;高药物组次之,为29.78%;低药物组及中药物组细胞凋亡程度较轻,生存状态较佳,分别为12.15%和6.08%.Western Blot结果显示:与对照相比较,p-ERK、ERK及Akt磷酸化水平在各组中表达均显著下降(P<0.05);与损伤组相比,低药物组、中药物组和高药物组三组p-ERK、ERK及Akt磷酸化水平升高(P<0.05);与低药物组相比,中药物组中p-ERK、ERK及Akt磷酸化水平升高(P<0.05).结论 黄芪多糖可提高人心肌细胞缺血再灌注损伤后ERK、Akt的活性,减少细胞凋亡.

目的:探讨小檗碱对高糖引起的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)和人心脏微血管内皮细胞(HC-MEC)损伤的保护作用.方法:采用含5mM葡萄糖的完全培养基培养的HUVEC和HCMEC为对照组;含30、50、100、200mM葡萄糖的完全培养基培养的HUVEC和HCMEC为各高糖组;含100mM葡萄糖和0. 01、0. 1、1μM小檗碱的完全培养基培养的HUVEC和HCMEC为各小檗碱组,各组处理24h和48h后应用MTT法检测细胞活力.应用诱导型一氧化氮合酶(iNOS)试剂盒检测HUVEC细胞iNOS活性.结果:与对照组比较,30、50、100、200 mM葡萄糖浓度依赖性引起HUVEC和HCMEC的细胞活力依次下降(P<0. 05).同组细胞处理48h与24h比较,随着作用时间的延长细胞活力降低越明显.0. 01μM、0. 1μM和1μM小檗碱组较l00mM高糖组细胞活力在一定程度上有所改善(P<0. 05).与对照组比较,高糖组HUVEC的iNOS活性增加(P<0. 01),小檗碱组较高糖组iNOS活性明显降低(P<0. 01).结论:30-200 mM高糖可造成HUVEC和HCMEC损伤,小檗碱对损伤有一定的保护作用,其作用和下调iNOS活性有关.

目的:通过模拟"缺血后处理"的效应机制, 观察心肌细胞在缺血再灌注损伤过程中线粒体膜通透性转换孔 (mitochondrial permeability transitionpore, m PTP) 开放程度、线粒体膜电位 (mitochondrial membrane potential, △Ψm) 、钙离子浓度, 以及Caspase-3、Caspase-9等指标, 以探索黄芪多糖产生心肌保护作用的线粒体机制.方法:培养原代人心脏微血管内皮细胞 (human cardiac microvascular endothelial cells, HCMEC), 通过缺氧再复氧刺激细胞损伤模拟缺血再灌注损伤的实验技术平台, 利用缺氧再复氧即刻给药的方法, 模拟缺血后处理的效应机制, 以阳性药物SB203580为对照组, 探讨黄芪多糖后处理对缺氧再复氧人心肌细胞m PTP开放等作用.随机分为:A.HCMEC正常对照组;B.HCMEC损伤组;C.HCMEC损伤+黄芪多糖组;D.HCMEC损伤+SB203580组.结果:与HCMEC正常对照组相比, HCMEC损伤组m PTP的开放程度、线粒体钙离子浓度显著升高 (P＜0.05), 而线粒体膜电位水平降低 (P＜0.05), 而经黄芪多糖后处理m PTP的开放程度、线粒体钙离子浓度水平明显降低 (P＜0.05), 而线粒体膜电位水平升高 (P＜0.05) .与HCMEC正常对照组相比, HCMEC损伤组Caspase-3、Caspase-9呈强阳性表达 (P＜0.05), 而HCMEC损伤+黄芪多糖组Caspase-3、Caspase-9明显降低 (P＜0.05) .结论:黄芪多糖后处理可通过减轻钙超载, 保护膜电位水平而抑制m PTP的过度开放, 从而减轻缺血再灌注损伤对线粒体膜结构的破坏, 保护线粒体功能.黄芪多糖后处理可通过减轻钙超载, 保护膜电位水平而抑制m PTP过度开放.并可抑制上游启动型蛋白Caspase-9的高表达, 进而通过凋亡级联反应, 抑制下游执行型Caspase-3蛋白的表达.

目的:探讨白藜芦醇延缓人心脏微血管内皮细胞衰老的作用,从细胞骨架角度分析其作用机制.方法:通过热休克蛋白27(HSP27) shRNA细胞系的建立,将组别为8代复制性衰老模型组(衰老组),白藜芦醇组(10 μmol·L-1),空载质粒(Mock)组,HSP27shRNA组,HSP27shRNA+白藜芦醇组(10 μmol·L-).运用β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老,细胞计数(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞增殖能力,激光免疫共聚焦显微镜观察纤维状肌动蛋白(F-actin)和球型蛋白单体(G-actin)的形态学改变,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测F-actin蛋白的表达情况.结果:与衰老组比较,白藜芦醇组β-半乳糖苷酶染色比例下降(P＜0.01),细胞增殖能力增加(P＜0.01),F-actin线条较为完整的分布于细胞边缘,G-actin圆润饱满的分布于细胞中央,蛋白表达减少(P＜0.01);热休克蛋白27 (heat shock protein 27,HSP27)沉默后,与Mock组比较,HSP27shRNA组及HSP27shRNA+白藜芦醇组β-半乳糖苷酶染色比例增加(P＜0.01),细胞增殖能力下降(P＜0.01),F-actin外周致密带边缘变得毛糙不规整,崩解消散,细胞的形状不能清晰的呈现;G-actin表现为边缘变模糊呈絮状向外延伸,而细胞中央区域染色离散,形态不规则,F/G-actin的平均光密度值下降(P＜0.01),蛋白表达减少(P＜0.01).结论:白藜芦醇能够延缓内皮衰老,促进增殖,其中HSP27下调F-actin的表达可能是白藜芦醇延缓内皮衰老的重要机制所在.

目的 探讨灯盏花乙素(scutellarin,SCU)对正常及缺氧再给氧(hypoxia reoxygenation,HR)处理时人心脏微血管内皮细胞(human cardiac microvascular endothelial cells,HCMECs)中PKCε蛋白及mRNA表达的调控作用.方法 以正常与缺氧再给氧2种方式培养HCMECs,实验分组为:在正常培养实验中分为正常对照(Control)组、SCU (0.1 μM,1μM,10 μM)3种剂量组;HR培养实验中分为Control组、Model (HR)组、HR处理的SCU(0.1 μM, 1μM, 10 μM)3种剂量组.分别以Western blot与RT-PCR方法检测HCMECs中p-PKCε与PKCε蛋白与mRNA表达的变化.结果 在正常培养的HCMECs中,SCU (0.1 μM,lμM, 10μM)剂量组均可显著上调PKC ε的蛋白及mRNA的表达(P＜0.05),对p-PKCε也有上调趋势;在HR培养的细胞实验中,Model组PKC￡有下调趋势,而SCU 10 μM组可显著上调PKC￡的蛋白及mRNA的表达(P＜0.05),并且SCU 10 μM亦可显著上调p-PKC￡(P＜0.05).结论 SCU对正常及HR处理时HCMECs中PKC ε蛋白及mRNA的表达有明显的上调作用.

目的 探讨乌司他丁(UTI)对人心脏微循环内皮细胞(HCMEC)释放炎性因子的影响.方法 将体外培养的HCMEC细胞按以下分组方法进行实验:①对照组,在HCMEC细胞培养体系中加入2 mL的体外循环血清;②UTI-H组,HCMEC细胞培养体系+2 mL体外循环血清+1000单位/mL的UTI;③UTI-M组,HCMEC细胞培养体系+2 mL体外循环血清+500单位/mL的UTI;④UTI-L组,HCMEC细胞培养体系+2 mL体外循环血清+100单位/mL的UTI.每组各9个培养皿.检测各组细胞培养液上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素10(IL-10)、核转录因子κB(NF-κB)的含量.结果 (1)UTI-H组、UTI-M组和UTI-L组细胞培养液上清液中的NF-κB水平分别为(0.04±0.005)ng/mL、(0.06±0.002)ng/mL和(0.07±0.003)ng/mL,明显低于对照组的(0.10±0.006)ng/mL,且UTI-H组NF-κB水平明显低于UTI-M组和UTI-L组,差异均有统计学意义(P<0.05);(2)UTI-L组、UTI-M组和UTI-H组细胞培养液上清液中的TNF-α水平分别为(0.71±0.09)ng/L、(0.66±0.05)ng/L、(0.32±0.04)ng/L,明显低于对照组的(1.45±0.06)ng/L,且UTI-H组的TNF-α水平明显低于UTI-M组和UTI-L组,差异均有统计学意义(P<0.05);(3)UTI-L组、UTI-M组和UTI-H组细胞培养液上清液中的IL-10水平分别为(1.29±0.12)ng/L、(2.33±0.15)ng/L、(4.42±0.36)ng/L,明显高于对照组的(0.76±0.09)ng/L,UTI-H组的IL-10水平明显高于UTI-M组和UTI-L组,UTI-M组IL-10明显高于UTI-L组,差异均有统计学意义(P<0.05);(4)UTI-L组和UTI-M组的NF-κB和TNF-α水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05).结论 乌司他丁能明显降低HCMEC细胞释放TNF-α、NF-κB水平和提升HCMEC细胞释放IL-10因子水平.

目的 探讨不同剂量乌司他丁(ulinastatin,UTI)对人心脏微循环内皮细胞(Human Cardiac microvascular endothelial cell,HCMEC)体外循环血清损伤的作用.方法 以体外培养的HCMEC为研究细胞,分为5组:空白对照组;体外循环组;UTI大剂量组(1000 U/mL);UTI中剂量组,(500 U/mL);⑤UTI小剂量组(100 U/mL).每组各9个培养皿.记录各组细胞存活率;检测各组细胞上清液中NO(Nitric oxide)、ET-1(endothelin-1)的含量.结果(1)空白对照组相对细胞存活率高于体外循环组(<0.05),而体外循环组相对细胞存活率低于UTI各剂量组(<0.05),UTI大剂量组相对细胞存活率明显高于UTI中小剂量组(<0.05);(2)体外循环组NO、ET-1均高于空白对照组(<0.05);(3)UTI各剂量组ET-1低于体外循环组(<0.05),而NO均高于体外循环组(<0.05);(4)UTI大剂量组NO明显高于UTI中小剂量组(<0.05),但ET-1明显低于UTI中小剂量组(<0.05);(5)UTI小剂量组与UTI中剂量组在NO差异无统计学意义(>0.05).结论(1)UTI对人体外循环血清损伤HCMEC的有一定的保护作用;(2)体外循环血清损伤HCMEC过程中,大剂量UTI较中小剂量UTI保护作用好.

目的 探讨黄芪多糖(astragalus polysaccharide,APS)对缺氧/复氧人心脏微血管内皮细胞(human cardiac microva-scular endothelial cell,HCMEC)凋亡、细胞周期的影响.方法 培养原代HCMEC,通过缺氧/复氧刺激HCMEC,模拟缺血再灌注损伤,建立缺血再灌注损伤模型.将造模成功的HCMEC随机分为5组:对照组、模型组、APS低浓度组(25μg/ml)、APS中浓度组(50μg/ml)和APS高浓度组(100μg/ml).通过流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期.通过蛋白质印迹法测定caspase-3、caspase-9蛋白表达水平.结果 模型组细胞凋亡率显著高于对照组和APS低、中、高浓度组(均P<0.01).模型组S期细胞显著增加,细胞在S期被阻滞并促进了细胞凋亡,但APS逆转了这一现象.模型组caspase-3和caspase-9蛋白表达水平均显著高于对照组和APS低、中、高浓度组(均P<0.05).结论 APS可保护HCMEC免受缺血再灌注损伤,这种保护作用可能与改变细胞周期分布、调节caspase-3和caspase-9蛋白表达有关.