目的:探讨老年2型糖尿病(T2DM)合并非酒精性脂肪肝(NAFLD)患者血清蛋白激酶Cε(PKCε)活性与胰岛素抵抗的相关性。方法:回顾性分析2017年10月至2018年10月西安交通大学医学院第二附属医院住院的T2DM患者229例，根据病情分为T2DM组112例，T2DM＋NAFLD组117例，另选同期健康对照组110例。比较3组入选者临床资料和实验室检查结果，计算稳态模型的胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)，采用酶联免疫吸附法测定血清PKCε活性，并分析其与胰岛素抵抗的相关性。结果:T2DM＋NAFLD组患者血清PKCε活性和HOMA-IR均高于单纯T2DM组和健康对照组[(195.5±62.1)μg/L比(188.7±61.2)μg/L和(89.1±20.2)μg/L、(12.5±7.9比14.1±5.7和5.8±4.1)， F值分别为9.76、10.21，均 P＝0.010]。 Pearson相关分析，T2DM＋NAFLD组患者血清PKCε活性、HOMA-IR及三酰甘油呈正相关( r值分别为0.339、0.305、0.329，均 P<0.015)。Logistic回归分析，血清PKCε活性、HOMA-IR和三酰甘油是T2DM＋NAFLD组的危险因素( β值分别为0.849、0.022和0.710，均 P<0.05)。血清PKCε活性升高是T2DM合并NAFLD的独立影响因素。 结论:老年T2DM合并NAFLD患者血清PKCε活性升高与胰岛素抵抗呈正相关，降低血清PKCε活性和改善胰岛素抵抗有助于延缓或改善T2DM及NAFLD。

目的 探讨补阳还五汤对脑缺血再灌注(I/R)大鼠线粒体氧化损伤及PKCε-Nampt通路的影响.方法 大鼠随机分为假手术组、模型组、补阳还五汤组(14.3 g/kg)和依达拉奉组(3 mg/kg),除假手术组外均采用MCAO法建立脑I/R损伤模型,术后 24h各组给予相应剂量药物,给药 7d后通过神经功能评分评估神经功能缺损情况,免疫荧光检测神经元标志物MAP-2表达,观察神经元损伤情况,检测ROS、MDA水平和SOD活性评价氧化损伤情况,荧光探针JC-1 检测线粒体膜电位变化,修饰酶循环法检测 NAD+/NADH 比值,Western blot 法检测 PKCε、p-PKCε、Nampt蛋白表达,免疫组化法检测p-PKCε、Nampt蛋白阳性表达.结果 与模型组比较,补阳还五汤组脑梗死体积、神经功能评分降低(P<0.05),脑组织MAP-2荧光强度增强(P<0.05),神经元损伤减轻,脑组织ROS、MDA水平降低(P<0.05),SOD活性、线粒体膜电位、NAD+/NADH比值升高(P<0.05),p-PKCε、Nampt蛋白表达升高(P<0.05).结论 补阳还五汤可通过激活PKCε-Nampt信号通路、提高线粒体功能来减轻大鼠脑I/R损伤.

目的 基于肠TPH1-肝HTR2A轴探讨茵陈蒿汤防治MAFLD的作用机制.方法 24只C57BL/6J小鼠随机分为对照组、模型组、茵陈蒿汤组,每组8只.模型组、茵陈蒿汤组小鼠采用高脂饲料喂饲,12周后,茵陈蒿汤组给予茵陈蒿汤灌胃,每日1次,连续4周.采用HE染色和油红O染色观察肝脏组织病理变化,检测血清HDL-C、LDL-C、TC、TG、AST、ALT和5-HT含量,肝脏TC、TG、DAG、PLC含量,小肠TPH1、SERT及肝脏HTR2A、SREBP-1c、GPAT1、FASN mRNA水平,小肠TPH1、SERT及肝脏HTR2A、PKC-ε、P-PI3K、P-AKT、P-mTOR、SREBP-1c、GPAT1、FASN蛋白表达.结果 对照组肝细胞排列整齐,无明显脂肪变性;模型组肝细胞体积肿胀,有明显脂肪变性;与模型组比,茵陈蒿汤组肝细胞脂肪变性显著减少.相较于对照组,模型组肝脏脂质沉积显著升高,茵陈蒿汤显著改善肝脏脂质沉积.与对照组比,模型组肝脏TG和TC水平显著升高(P<0.05);血清AST、ALT、HDL-C、LDL-C、TG、TC水平显著升高(P<0.05);血清5-HT及肝脏DAG、PLC水平显著升高(P<0.05);小肠TPH1及肝脏HTR2A、SREBP-1c、GPAT1、FASN mRNA表达水平显著升高,小肠SERT mRNA表达水平显著降低(P<0.05);小肠TPH1及肝脏HTR2A、PKC-ε、P-PI3K、P-AKT、P-mTOR、SREBP-1c、GPAT1、FASN蛋白表达水平显著升高,小肠SERT蛋白表达水平显著降低(P<0.05).与模型组比,茵陈蒿汤组肝脏TG和TC水平显著降低(P<0.05);血清AST、ALT、HDL-C、LDL-C、TG、TC水平显著降低(P<0.05);血清5-HT及肝脏DAG、PLC水平显著降低(P<0.05);小肠TPH1及肝脏HTR2A、SREBP-1c、GPAT1、FASN mRNA表达水平显著降低,小肠SERT mRNA表达水平显著升高(P<0.05);小肠TPH1及肝脏HTR2A、PKC-ε、P-PI3K、P-AKT、P-mTOR、SREBP-1c、GPAT1、FASN蛋白表达水平显著降低,小肠SERT蛋白表达水平显著升高(P<0.05).结论 茵陈蒿汤可能通过肠TPH1-肝HTR2A轴调节肝脏TG合成,从而抑制MAFLD发生发展.

目的:研究脑顶叶皮质水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)在褪黑素(melatonin,MT)治疗胆红素脑病(bilirubin encephalopathy,BE)中的表达变化,以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)/蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)信号通路在MT对AQP4调控中的作用,以探讨MT对BE的治疗机制.方法:80只出生5～7 d的健康SD乳鼠,根据其处理方式,随机分为以下5组:假手术组、BE模型组、MT干预组、PKC抑制剂(PKC inhibitor,PKCi)干预组和mTOR抑制剂(mTOR inhibitor,mTORi)干预组.采用HE染色和尼氏染色检测各组鼠脑皮质病理改变;采用干-湿重法测定各组脑顶叶皮质含水量;应用免疫荧光染色法检测脑皮质AQP4的表达区域;运用TUNEL染色法检测脑顶叶皮质神经细胞的凋亡变化;使用Western blot法测定各组鼠脑顶叶皮质AQP4、caspase-3、cleaved caspase-3和PKCε的表达量.结果:HE和尼氏染色显示,MT可减轻胆红素所致神经细胞的损伤.干-湿重法结果显示,MT可降低BE乳鼠脑顶叶皮质脑含水量.免疫荧光染色显示,BE组AQP4荧光强度增加,主要表达于大脑顶叶皮质血管壁和星形胶质细胞膜;MT干预可阻止BE所致AQP4表达的增加.TUNEL染色显示,MT可减少BE所致细胞凋亡.Western blot显示,与假手术组相比,BE组脑顶叶皮质AQP4、cleaved caspase-3和caspase-3表达增加,PKCε表达降低;MT干预可降低BE鼠顶叶皮质AQP4、cleaved caspase-3和caspase-3表达,增加PKCε表达.PKCi和mTORi均可下调PKCε的表达,阻止MT通过mTOR/PKC信号通路降低AQP4的表达.结论:MT可通过减少BE大鼠脑顶叶皮质中AQP4的表达来缓解脑水肿,并减少caspase-3介导的神经细胞凋亡.MT下调AQP4表达的机制与mTOR/PKC信号通路的激活有关.

目的 观察阿霉素(DOX)对坐骨神经慢性缩窄性损伤(CCI)模型大鼠的镇痛作用,并从形态学及组织凋亡蛋白的角度对其机制进行分析.方法 将SD大鼠随机分为4组:假手术组(Sham)、CCI模型组(Model)、假手术+阿霉素5 mg·kg-1组(Sham+DOX)、CCI模型+阿霉素5 mg·kg-1组(Model+DOX).造模成功后,各组采用尾静脉注射的方式给药,Sham组和Model组给予等量生理盐水,检测各组大鼠机械痛阈值和热痛阈值.在行为学检测结束后,即手术后d 15取大鼠右侧L4-5 DRG,观察DRG细胞形态、超微结构及DOX的分布情况,采用Western blot法测定DRG组织中Bax、Bcl-2、PKCɑ、PKCδ及PKCε的蛋白表达.结果 静脉注射DOX可在DRG组织检测到其自发荧光表达.与Sham组相比,Sham+DOX组痛阈值在整个观察期未见差别,而Model组在术后d 7痛阈值明显降低.与Model组相比,Model+DOX组的痛阈值在给药后明显回升,并表现出DRG细胞明显损伤,Bax/Bcl-2升高以及PKCδ、PKCε的蛋白表达量降低等现象.结论 DOX静脉注射可以到达并蓄积于DRG组织,明显减轻CCI大鼠的疼痛反应,这一作用与其降低PKCδ和PKCε的蛋白表达,诱导DRG的凋亡有关.

目的:观察芝麻素对肥大细胞活化和炎症介质释放的影响并探讨其可能的作用机制.方法:体外培养HMC-1细胞,用10 μg/ml的anti-DNP IgE处理细胞6 h后,再用100 ng/ml的DNP-HAS孵育10 min诱导HMC-1细胞活化,在DNP-HAS处理前给予最终浓度25、50和100 μg/L芝麻素预处理30 min后光镜下观察芝麻素对肥大细胞脱颗粒的影响,ELISA法检测芝麻素对肥大细胞组胺、TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8释放的影响,Western blot方法观察芝麻素对FcεRI受体下游信号Lyn和Syk,PKCα激活,IκBα磷酸化和NF-κB活化的影响.结果:DNP-HAS能明显诱导HMC-1细胞脱颗粒,促进组胺和TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-8等细胞因子的释放,激活 FcεRI受体下游信号分子 Lyn、Syk和 PKCα,磷酸化 IκBα,促进 NF-κB活化(P<0.05).芝麻素高(100 μg/L)、中(50 μg/L)浓度能明显抑制HMC-1细胞脱颗粒和炎症介质的释放,阻断FcεRI受体下游信号激活,抑制NF-κB活化(P<0.05).结论:芝麻素通过PKCα/NF-κB途径抑制肥大细胞活化和炎症介质释放.

目的 探讨外周神经元蛋白酶激活受体2-蛋白激酶A/蛋白激酶Cε(PAR2-PKA/PKCε)通路在痛转化中的作用,寻找同时干预急性痛和慢性痛的可能方案.方法 SD大鼠随机分为空白组、假诱发组、诱发组、抑制剂1组和抑制剂2组.除空白组和假诱发组,所有大鼠均通过先后足部注射角叉菜胶和前列腺素E2(PGE2)建立痛觉敏化诱发模型.PGE2于角叉菜胶注射后7 d进行足部注射.抑制剂1组和抑制剂2组大鼠于PGE2注射前/后,分别给予PAR2抑制剂.观察角叉菜胶/生理盐水,注射前、注射后5h、3d、6d、7d0.5h、7d4h和7d24h大鼠机械痛阈(PWTs)的变化,检测角叉菜胶注射后7 d 24 h造模侧背根神经节(DRG)中PAR2、蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶(PKCε)表达.结果 痛觉敏化诱发模型建立成功.角叉菜胶注射后7 d给予PGE2,显著延长了PGE2诱发疼痛的存在时间,角叉菜胶注射后7 d 24 h假诱发组大鼠PWTs与同期空白组相比差异无显著性(P>0.05),而诱发组大鼠PWTs明显低于同期空白组和假诱发组大鼠(P<0.01).诱发组大鼠造模侧DRG中PAR2和PKCε表达在角叉菜胶注射后7 d 24 h明显提升,高于同期假诱发组和空白组(P<0.05).给予PAR2抑制,不论时间均能显著翻转角叉菜胶注射后7 d 24 h,诱发组大鼠由PGE2诱发的疼痛(P<0.05),并抑制DRG中PKCε表达.但,给予PAR2抑制剂不能影响PGE2诱发的急性疼痛和调制DRG中PKA含量.结论 抑制PAR2表达能阻断急性痛向慢性痛转化,这可能与其抑制DRG中PAR2-PKCε通路激活有关.但抑制PAR2并不能干预急性痛,这可能是因为DRG中PAR2相关通路未参与急性痛的产生.

目的 探讨远程缺血预处理(RIPC)对兔脊髓缺血再灌注损伤(SCIRI)时脑源性神经营养因子(BDNF)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(PKC)ε蛋白和mRNA含量的影响及其意义.方法 日本大耳白兔36只,随机均分为假手术组(S组)、缺血性损伤组(IR组)、IR+ RIPC组.每组6只动物分别于再灌注第2天和第5天处死.S组不阻断腹主动脉,IR组和IR+RIPC组夹闭腹主动脉30分钟建立SCIRI模型,IR+RIPC组于主动脉阻断前1小时实施RIPC.3组动物在再灌注第2天和第5天行后肢神经功能评分后处死并取脊髓组织L3-L5段,评估病理学变化;用Western blotting和RT-PCR法分别检测脊髓组织 BDNF、PKCε蛋白及其 mRNA含量.结果 同一时间点,与IR组相比,IR+RIPC组后肢神经功能评分和脊髓组织病理切片分级明显改善(P<0.05),脊髓组织BDNF、PKCε蛋白及mRNA表达均明显升高(P< 0.05).结论 RIPC对兔SCI-RI有一定的防治作用,其作用机制与RIPC激活了PKCε/ PKC信号通路,进而上调脊髓损伤区域BDNF蛋白的表达有关.

目的 探讨α干扰素-1b调控蛋白激酶Cε(protein kinase Cε,PKCε)蛋白激酶Cε、蛋白激酶Cα(protein kinase Cα,PKCα)抑制肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)纤维化及机制.方法 采用不同浓度α干扰素-1b(100、200、400、800、1000 U/mL)处理HSC-T6细胞株,同步设置无α干扰素-1b处理的对照组;四甲基偶氮唑盐比色法分析HSC-T6细胞增殖;分析羟脯氨酸含量变化;免疫荧光染色检测PKCε和PKCα的表达,RT-PCR检测PKCε、PKCα、β-链蛋白(β-catenin)、生存素(Survivin)mRNA的水平.蛋白质印迹法检测PKCε、PKCα、β-catenin、Survivin蛋白水平.采用One-Way ANOVA分析.结果 给药24 h后,100、200、400、800、1000 U/mLα干扰素-1b组抑制率分别为(15.85±1.05)％ 、(36.59±1.03)％ 、(45.12±1.05)％ 、(50.00±1.01)％ 和(62.20±1.02)％,组间比较差异有统计学意义(F=27.478,P<0.01);48 h抑制率分别为(20.87±1.09)％ 、(43.96±1.08)％ 、(53.85±1.08)％ 、(64.84±1.06)％ 和(74.72±1.07)％,组间比较差异有统计学意义(F=25.321,P<0.01).48 h时半抑制浓度为343.47 U/mL.100、200、400 U/mLα干扰素-1b组的羟脯氨酸水平分别为(7.48±0.28)、(6.26±0.17)、(3.86±0.20)μg/mL,均低于对照组的(8.47±0.32)μg/mL,差异均有统计学意义(t值分别为4.033、10.564和21.160,均P<0.05).100、200、400 U/mLα干扰素-1b组的PKCε荧光强度均低于对照组,比较差异均有统计学意义(t值分别为1.984、2.457、7.771,均P<0.05);PKCα的荧光强度分别也均低于对照组,比较差异均有统计学意义(t值分别为9.232、15.921、22.222,均P<0.01).随着α干扰素-1b水平的增加,HSC-T6细胞PKCε、PKCα、β-catenin、Survivin mRNA水平较对照组明显下降,比较差异均有统计学意义(t值分别为7.020、24.562、45.701和14.241,均P<0.01).随着α干扰素-1b水平的增加,HSC-T6细胞PKCε、PKCα、β-catenin和Survivin蛋白水平较对照组明显降低,比较差异均有统计学意义(t值分别为9.564、4.409、10.036和6.794,均P<0.01).结论 α干扰素-1b能够剂量依赖性地下调肝星状细胞胶原表达,降低PKCε、PKCα、β-catenin、Survivin表达水平,抑制HSC-T6增殖.

BACKGROUND: The development of prostate cancer from a clinically localized, hormone-naive state to a hormonerefractory phenotype involves a complex interplay of protein kinase C (PKC) and activator protein-1 (AP-1). Therefore, the present study aimed to uncover the roles of PKC and AP-1 through midostaurin-mediated regulation—a multi-target protein kinase inhibitor. METHODS: Androgen Receptor-negative, hormone-refractory prostate cancer cells (PC-3) were used as an in-vitro model system. The effect of midostaurin on cell viability was assessed by an MTT assay. Expression studies on PKC-a, PKC-δ, different AP-1 transcription factors, and AP-1 regulating genes were analyzed by semiquantitative RT-PCR, and protein levels of Bcl-2 were evaluated by western blotting. RESULTS: Midostaurin decreased the viability of hormone-refractory PC-3 cells. Furthermore, midostaurin significantly induced the transcripts of apoptotic-mediated PKC-δ, tumor suppressor p53, cell cycle inhibitor p21cipl/wafl, death receptor TNF-a, pro-apoptotic Bax, and Caspase-8, and eventually inhibited the expression of pro-survival PKC-ε, pro-oncogene c-Jun, c-Fos, Fra-1, positive growth regulator cyclin Dl, and anti-apoptotic Bcl-2. In addition, midostaurin also decreased the protein expression of anti-apoptotic Bcl-2. CONCLUSION: The present study provided evidence that midostaurin suppresses tumor growth and induces apoptosis in hormone-refractory PC-3 cells via modulation of PKC-δ and PKC-ε expression, and regulation of PMA-altered c-Jun, c-Fos, and Fra-1 AP-1 transcription factors and their target genes involved in cell cycle regulation (cyclin Dl, p53, p21, Bcl-2, and TNF-a). Thus, pharmacological targeting of PKC and AP-1 factors may have therapeutic potential against hormone-refractory prostate cancer.