目的:观察白细胞介素6（IL-6）对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）表型和功能的影响，探索IL-6在内皮-间充质转化（EndMT）过程中的作用。方法:采用实验研究方法。取产妇行分娩手术后弃用的新鲜正常胎儿脐带，分离培养原代细胞的第2天在倒置相差显微镜下观察细胞形态；免疫荧光法鉴定第4代细胞是否为HUVEC后，取2批第3～5代HUVEC，用于后续实验。将第1批细胞按随机数字表法（下同）分为6组：空白对照组、5 ng/mL IL-6组、10 ng/mL IL-6组、25 ng/mL IL-6组、50 ng/mL IL-6组、100 ng/mL IL-6组，将第2批细胞分为4组：空白对照组、10 ng/mL IL-6组、25 ng/mL IL-6组、50 ng/mL IL-6组；空白对照组仅加入完全培养液，其余各组细胞还加入相应终质量浓度的IL-6。第1批细胞，分组培养后72 h，倒置相差显微镜下观察6组HUVEC形态；免疫荧光法检测6组HUVEC凝血因子Ⅷ和α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的阳性表达，并计算双阳性细胞数占凝血因子Ⅷ阳性细胞数的比值（以下简称双阳性细胞数的比值），样本数为6；实时荧光定量反转录PCR法检测6组HUVEC 血管内皮钙黏蛋白和α-SMA蛋白的mRNA表达量，样本数为3。第2批细胞，分组培养后72 h，蛋白质印迹法检测4组HUVEC 血管内皮钙黏蛋白、α-SMA和Ⅰ型胶原的蛋白表达量，样本数为3。对数据行单因素方差分析、Bonferroni校正。结果:原代分离培养的第2天细胞呈短梭形或多边形，免疫荧光法鉴定第4代细胞为HUVEC。第1批细胞，分组培养后72 h，6组细胞随IL-6浓度的逐渐增加，其形态向长梭形变化，细胞间连接减少或消失、间隙变大。分组培养后72 h，与空白对照组双阳性细胞数的比值相比，25 ng/mL IL-6组、50 ng/mL IL-6组、100 ng/mL IL-6组显著增高（ P<0.01）；与5 ng/mL IL-6组双阳性细胞数的比值相比，25 ng/mL IL-6组、50 ng/mL IL-6组和100 ng/mL IL-6组显著升高（ P<0.01）；与10 ng/mL IL-6组双阳性细胞数的比值相比，50 ng/mL IL-6组和100 ng/mL IL-6组显著升高（ P<0.01）；100 ng/mL IL-6组双阳性细胞数的比值均显著高于25 ng/mL IL-6组、50 ng/mL IL-6组（ P<0.01）。分组培养后72 h，与空白对照组细胞血管内皮钙黏蛋白的mRNA表达量比，25 ng/mL IL-6组、50 ng/mL IL-6组和100 ng/mL IL-6组明显下降（ P<0.05或 P<0.01）；与5 ng/mL IL-6组细胞血管内皮钙黏蛋白的mRNA表达量比较，50 ng/mL IL-6组和100 ng/mL IL-6组均明显下降（ P<0.01）；与10 ng/mL IL-6组细胞血管内皮钙黏蛋白的mRNA表达量比较，50 ng/mL IL-6组和100 ng/mL IL-6组明显下降（ P<0.01）；与25 ng/mL IL-6组细胞血管内皮钙黏蛋白mRNA的表达量比较，50 ng/mL IL-6组和100 ng/mL IL-6组明显下降（ P<0.01）。分组培养后72 h，5 ng/mL IL-6组、10 ng/mL IL-6组、25 ng/mL IL-6组、50 ng/mL IL-6组、100 ng/mL IL-6组细胞 α-SMA的 mRNA表达水平显著高于空白对照组（ P<0.05或 P<0.01）。第2批细胞分组培养后72 h，与空白对照组细胞血管内皮钙黏蛋白的蛋白表达量1.391±0.026比较，10 ng/mL IL-6组（1.185±0.063）、25 ng/mL IL-6组（0.717±0.078）、50 ng/mL IL-6组（0.293±0.064）显著降低（ P<0.05）；与10 ng/mL IL-6组细胞血管内皮钙黏蛋白的蛋白表达量比较，25 ng/mL IL-6组、50 ng/mL IL-6组显著降低（ P<0.01）；与25 ng/mL IL-6组细胞血管内皮钙黏蛋白的蛋白表达量比较，50 ng/mL IL-6组显著降低（ P<0.01）。分组培养后72 h，与空白对照组细胞α-SMA的蛋白表达量比较，10 ng/mL IL-6组、25 ng/mL IL-6组、50 ng/mL IL-6组显著升高（ P<0.01）；与10 ng/mL IL-6组细胞α-SMA的蛋白表达量比较，25 ng/mL IL-6组、50 ng/mL IL-6组显著增加（ P<0.01）。分组培养后72 h，与空白对照组细胞Ⅰ型胶原的蛋白表达量比较，25 ng/mL IL-6组、50 ng/mL IL-6组显著增加（ P<0.05）。 结论:IL-6作用于HUVEC后，细胞的表型和功能呈浓度依赖性表现为间质细胞的特征。炎症因子可促进EndMT进程，成为调控组织纤维化机制的重要因子之一。

目的:探讨LINC00472对脂多糖(LPS)诱导的血管内皮细胞氧化损伤的影响及其机制。方法:LPS诱导人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)建立血管内皮细胞氧化损伤模型，将si-NC、si-LINC00472、微小RNA(miR)-NC、miR-496 mimics、si-LINC00472与anti-miR-NC(共转染)、si-LINC00472与anti-miR-496分别转染至HUVECs；实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测LINC00472和miR-496表达；检测乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量；流式细胞仪检测细胞凋亡率；双荧光素酶报告实验检测LINC00472与miR-496的靶向关系；蛋白质印迹法检测裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved-Caspase-3)、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(cleaved-Caspase-9)蛋白表达。两组间比较行 t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD- t检验。 结果:LPS组HUVECs中LINC00472的表达量高于Con组(2.77±0.25比0.93±0.02)，miR-496的表达低于Con组(0.35±0.03比0.91±0.03)，差异有统计学意义( t＝21.231、64.789， P<0.05)。LPS+si-LINC00472组LDH的活性和MDA表达低于LPS+si-NC组[LDH活性(212.58±17.33) U/L比(662.85±29.17) U/L、MDA(3.93±0.32) nmol/mg比(13.42±1.26) nmol/mg]，SOD活性高于LPS+si-NC组[(58.31±5.76) U/mg比(17.87±1.65) U/mg]，差异有统计学意义( t＝52.399、42.608， P<0.05)。LPS+si-LINC00472组细胞凋亡率、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9蛋白表达低于LPS+si-NC组[(9.86±0.85)%比(26.49±2.17)%、0.31±0.03比0.67±0.06、0.21±0.02比0.58±0.05]，差异有统计学意义( t＝41.245、35.291、19.738， P<0.05)。LPS+miR-496组细胞LDH活性、MDA水平、细胞凋亡率、cleaved-Caspase-3和cleaved-Caspase-9蛋白表达低于LPS+miR-NC组[(254.91±21.97) U/L比(651.05±26.25) U/L、(5.64±0.47) nmol/mg比(14.17±1.05) nmol/mg、(12.92±1.13)%比(25.18±2.16)%、0.37±0.03比0.68±0.05、0.29±0.02比0.57±0.03]，SOD活性高于LPS+miR-NC组(49.01±4.12比18.02±1.53)，差异有统计学意义( t＝34.718、22.245、21.154、15.088、15.949、23.297， P<0.05)。LPS+si-LINC00472+anti-miR-496组细胞LDH活性、MDA水平、细胞凋亡率、cleaved-Caspase-3和cleaved-Caspase-9蛋白表达高于LPS+si-LINC00472+anti-miR-NC组[(594.06±27.59) U/L比(206.34±21.91) U/L、(9.48±0.77) nmol/mg比(3.88±0.25) nmol/mg、(19.64±1.18)%比(9.34±0.71)%、0.57±0.04比0.29±0.03、0.47±0.04比0.20±0.02]，SOD活性低于LPS+si-LINC00472+anti-miR-NC组(27.52±2.53比56.58±5.44)，差异有统计学意义( t＝33.015、20.752、14.531、22.438、16.800、18.112， P<0.05)。 结论:LINC00472可通过促进miR-496表达来抑制氧化应激及细胞凋亡，并减轻LPS诱导的血管内皮细胞氧化损伤。

目的:探究驱动蛋白家族成员23(KIF23)在骨肉瘤组织中的表达水平，在骨肉瘤中的调控方式。方法:收集2015年3月至2023年3月期间郑州大学第一附属医院30例骨肉瘤患者手术切除的肿瘤及癌旁组织标本，全部病例均经过病理证实，其中男18例，女12例，年龄(14.0±1.9)岁。利用KIF23特异性抗体检测其在人骨肉瘤组织及癌旁组织中的表达量，并利用KIF23特异的短发卡(shRNA)质粒在成骨肉瘤细胞(U2-OS)及人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)中下调KIF23的表达，通过噻唑蓝(MTT)，细胞计数试剂盒(CCK-8)及划痕实验检测KIF23对内皮细胞增殖及迁移的影响。内皮细胞体外成管(Tube formation)实验检测对HUVEC体外成管的影响。蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞增殖及迁移相关标志物的表达；定量聚合酶链反应(qPCR)检测相关mRNA的表达；裸鼠成瘤实验检测下调KIF23后裸鼠体内成瘤情况。结果:KIF23的mRNA水平在骨肉瘤组织中较对照组差异有统计学意义( P<0.01)；U2-OS细胞中，细胞增殖和细胞迁移在转染组中较对照组差异有统计学意义( P<0.01)；HUVEC中，转染组较对照组在细胞增殖和迁移差异有统计学意义( P<0.01)；KIF23敲低组较对照组在肿瘤质量差异有统计学意义( P<0.01)，体积差异也有统计学意义( P<0.01)。 结论:KIF23调控体内外骨肉瘤细胞增殖迁移及内皮细胞增殖迁移，进一步调控肿瘤进展及血管新生过程。

目的:探讨环状RNA VMA21(circ_VMA21)对脂多糖(LPS)诱导的血管内皮细胞损伤和氧化应激的影响及其机制。方法:人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)随机分为Control、LPS、LPS+pcDNA-circ_VMA21、LPS+pcDNA、LPS+微小RNA(miR)-122-5p inhibitor、LPS+anti-miR-NC、LPS+pcDNA-circ_VMA21+miR-122-5p mimic组；实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测circ_VMA21和miR-122-5p的表达水平；细胞计数检测细胞活性；流式细胞术检测细胞凋亡；蛋白质印迹法检测蛋白表达；酶联免疫吸附法检测丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)活性；双荧光素酶报告实验检测circ_VMA21和miR-122-5p的靶向关系。两组间均数比较采用 t检验，多组间比较采用单因素方差分析(组间两两比较采用LSD- t检验)。 结果:LPS诱导的HUVEC中circ_VMA21表达水平降低(0.17±0.02比1.00±0.00)，miR-122-5p表达水平升高(3.76±0.09比1.00±0.00)，细胞活性降低(0.41±0.02比1.22±0.07)，细胞凋亡率(24.17±0.93比7.62±0.39)及裂解的半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3(cleaved-Caspase-3)表达水平升高(0.80±0.06比0.13±0.01)，MDA含量[(736.11±27.21) nmol/ml比(159.37±14.93) nmol/ml]及LDH活性升高[(486.45±16.07) U/L比120.58±9.00) U/L]，SOD活性降低[(46.25±4.44) U/L比238.49±11.23) U/L， t＝9.721、13.122、15.321、22.472、10.817、38.123、18.237、25.522， P<0.05]；与LPS组和LPS+anti-miR-NC组比较，LPS+miR-122-5p inhibitor组miR-122-5p表达水平降低，细胞活性升高，细胞凋亡率及cleaved-Caspase-3表达水平降低，MDA含量及LDH活性降低，SOD活性升高( F＝2 564.169、693.501、540.990、704.667、41 336.059、1 170.734、414.559， P<0.05)。与LPS+pcDNA-circ_VMA21组比较，LPS+pcDNA-circ_VMA21+miR-122-5p mimic组miR-122-5p表达水平升高，细胞活性降低，细胞凋亡率及cleaved-Caspase-3表达水平升高，MDA含量及LDH活性升高，SOD活性降低( F＝810.792、298.432、376.370、279.806、634.476、528.520、343.420， P<0.05)。 结论:circ_VMA21通过下调miR-122-5p抑制脂多糖诱导的血管内皮细胞损伤和氧化应激。

目的:探讨问号钩端螺旋体(简称钩体)跨血管内皮细胞转运分子机制。方法:采用Transwell法了解问号钩体赖株穿越人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)单层能力。采用透射电镜和激光共聚焦显微镜法检测HUVEC内吞问号钩体后形成内吞泡情况。采用细胞内吞抑制试验确定HUVEC内吞问号钩体方式。采用激光共聚焦显微镜法检测HUVEC胞内问号钩体与溶酶体标志分子LAMP1共定位情况。采用暗视野显微镜Petroff-Hausser计数法检测HUVEC胞内问号钩体出胞情况。结果:问号钩体赖株能迅速穿越HUVEC细胞单层。问号钩体通过PI3K-微丝依赖的细胞内吞方式进入HUVEC并形成内吞泡。HUVEC胞内问号钩体不与LAMP1共定位，提示问号钩体内吞泡不与溶酶体融合。HUVEC胞内问号钩体通过FAK-微丝/微管途径出胞。结论:问号钩体通过跨细胞转运方式穿越人血管内皮细胞导致体内播散并加重病情。

目的:研究海姆泊芬-光动力对血管内皮细胞作用的分子学机制。方法:将体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)分为4组(细胞数为0.8×10 4/100 μl)，光动力处理组(海姆泊芬浓度5 μg/ml，光照剂量为4 J/cm 2)、单独加药组(仅加入5μg/ml海姆泊芬)、单独照光组(仅予以剂量为4 J/cm 2的光源照射)、空白对照组(不加光敏剂不照光)，分别检测上述不同组处理24 h后细胞的存活率，用Brdu检测细胞增殖情况，采用实时荧光定量PCR、蛋白质印迹法、免疫荧光检测上述处理前、后，细胞VEGF-Α/MAPK/ERK通路相关分子的mRNA和蛋白表达水平变化。 结果:应用SPSS18.0软件进行统计学分析，结果以均值±标准差表示， P<0.05表示差异有统计学意义。与空白对照组相比，光动力处理组血管内皮细胞活性[(0.45±0.08)比(1.02±0.11)， t＝12.02， P<0.05]和细胞增殖水平[(0.42±0.02)比(1.00±0.01)， t＝31.20， P<0.05)]显著下降，细胞中Ras[(0.62±0.02)比(1.05±0.03)， t＝10.35， P<0.05]，c-Raf [(0.72±0.04)比(1.00±0.05)， t＝7.35， P<0.05)]，Mek[(0.73±0.12)比(1.15±0.04)， t＝7.74， P<0.05]，Erk [(0.56±0.11)比(1.02±0.03)， t＝5.56， P<0.05]，VEGF-A[(0.34±0.04)比(1.02±0.07)， t＝7.59， P<0.05]，VEGFR2[(0.54±0.05)比(1.00±0.03)， t＝5.34， P<0.05]的mRNA表达下调，c-Raf [(0.44±0.02)比(1.02±0.05)， t＝46.7， P<0.05]，Mek[(0.72±0.05)比(1.05±0.04)， t＝5.35， P<0.05]，Erk [(0.62±0.15)比(1.03±0.03)， t＝8.58， P<0.05]的蛋白磷酸化水平以及VEGF-Α[(0.64±0.03)比(1.03±0.04)， t＝21.65， P<0.05]蛋白表达水平显著下调。 结论:海姆泊芬光动力通过抑制VEGF-Α/MAPK/ERK通路的表达抑制血管内皮细胞活性和增殖水平进而达到抑制血管增生和修复的目的。

目的:运用网络药理学方法探讨化瘀丸辅助免疫检查点抑制剂治疗三阴性乳腺癌（TNBC）的潜在作用机制。方法:利用TCMSP、PubChem、STITCH和SwissTargetPrediction数据库分析化瘀丸潜在作用靶点。基于癌症和肿瘤基因图谱（TCGA）数据库筛选TNBC疾病靶点。将药物-疾病映射靶点进行PPI网络构建、关键靶点筛选和模块分析，并运用DAVID数据库进行GO功能注释和KEGG信号通路富集分析。大鼠灌胃化瘀丸水煎液3.94 g/kg，连续给药4 d，制备含药血清。将人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）按随机数字表法分为对照组和实验组，实验组给予化瘀丸含药血清干预24 h后，接种于Matrigel已凝固的48孔板中，3 h后观察HUVEC血管形成情况。结果:获得化瘀丸治疗TNBC的可能作用靶点130个，VEGFA为核心作用靶点，血管生成、缺氧、凝血级联反应可能为化瘀丸治疗TNBC的主要相关功能及关键信号通路。体外研究表明，化瘀丸含药血清可促进HUVEC细胞肿瘤血管正常化。结论:化瘀丸可能通过VEGF靶点促进肿瘤血管正常化（血管生成、缺氧、凝血级联反应），可辅助免疫检查点抑制剂发挥治疗TNBC的功效。

目的:探讨严重烧伤患者休克期肝素结合蛋白（HBP）的变化及其在体外对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）和中性粒细胞的影响。方法:采用前瞻性观察性研究与实验研究方法。将2020年8—11月南京医科大学附属苏州医院烧伤整形科收治的符合入选标准的20例严重烧伤患者纳入严重烧伤组［男12例、女8例，年龄为44.5（31.0，58.0）岁］，同期招募该单位体检中心体检结果正常的20名健康志愿者纳入健康对照组［男13例、女7例，年龄为39.5（26.0，53.0）岁］。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测健康对照组志愿者血浆与严重烧伤组患者伤后48 h内血浆中HBP和组织金属蛋白酶抑制物1（TIMP-1）蛋白表达水平，分别对2组血浆中HBP和TIMP-1蛋白表达的相关性进行Pearson相关分析。取第4代对数生长期HUVEC进行实验，将细胞按随机数字表法（分组方法下同）分为常规培养的正常对照组（处理下同）与进行相应处理的重组HBP（rHBP）处理12 h组、rHBP处理24 h组、rHBP处理48 h组，采用实时荧光定量反转录PCR法检测细胞中TIMP-1的mRNA表达；将细胞分为正常对照组与进行相应处理的rHBP处理48 h组，采用蛋白质印迹法检测细胞中TIMP-1蛋白表达；将细胞分为正常对照组与加入相应试剂处理的单纯rHBP组、单纯抑蛋白酶多肽组、rHBP+抑蛋白酶多肽组（rHBP终物质的量浓度为200 nmol/L，抑蛋白酶多肽终质量浓度为20 μg/mL），培养48 h，采用ELISA法检测细胞培养上清液中TIMP-1蛋白表达水平。采用免疫磁珠分选法从前述10名健康志愿者外周静脉血中分离中性粒细胞，将细胞分为正常对照组与加入相应试剂处理的单纯重组TIMP-1（rTIMP-1）组、单纯佛波酯组、rTIMP-1+佛波酯组（rTIMP-1终质量浓度为500 ng/mL，佛波酯终物质的量浓度为10 nmol/L），培养1 h，采用免疫荧光法观测细胞中CD63蛋白表达，采用流式细胞术检测细胞中CD63蛋白阳性表达率，采用ELISA法检测细胞培养上清液中HBP和髓过氧化物酶（MPO）蛋白表达水平。正常对照组均于适宜时间点进行前述相关检测，细胞实验中各组样本数均为3。对数据行 χ2检验、Mann-Whitney U检验、Kruskal-Wallis H检验、Tamhane T2检验。 结果:严重烧伤组患者血浆中HBP、TIMP-1蛋白表达水平分别为404.9（283.1，653.2）、262.1（240.6，317.4）ng/mL，均明显高于健康对照组志愿者的61.6（45.0，68.9）、81.0（66.3，90.0）ng/mL（ Z值分别为-5.41、-5.21， P<0.01）。健康对照组志愿者血浆中HBP和TIMP-1蛋白表达相关性不强（ P>0.05），严重烧伤组患者血浆中HBP和TIMP-1蛋白表达呈明显正相关（ r=0.64， P<0.01）。与正常对照组比较，rHBP处理12 h组、rHBP处理24 h组、rHBP处理48 h组HUVEC中TIMP-1 mRNA表达水平均显著升高（ t值分别为-3.58、-2.25、-1.26， P<0.05）。蛋白质印迹法检测显示，与正常对照组比较，rHBP处理48 h组HUVEC中TIMP-1蛋白表达明显增强。培养48 h，与正常对照组比较，单纯rHBP组HUVEC培养上清液中TIMP-1蛋白表达水平显著升高（ t=9.43， P<0.05），单纯抑蛋白酶多肽组、rHBP+抑蛋白酶多肽组HUVEC培养上清液中TIMP-1蛋白表达水平均无明显变化（ P>0.05）；与单纯rHBP组比较，rHBP+抑蛋白酶多肽组HUVEC培养上清液中TIMP-1蛋白表达水平显著下降（ t=4.76， P<0.01）。培养1 h，免疫荧光法和流式细胞术检测的各组中性粒细胞CD63蛋白表达结果趋势一致。培养1 h，与正常对照组比较，单纯rTIMP-1组中性粒细胞中CD63蛋白阳性表达率及细胞培养上清液中HBP、MPO蛋白表达水平均无明显变化（ P>0.05），单纯佛波酯组、rTIMP-1+佛波酯组中性粒细胞中CD63蛋白阳性表达率及细胞培养上清液中HBP、MPO蛋白表达水平均明显升高（ t值分别为2.41、3.82，5.73、1.05、4.16、1.08， P<0.05或 P<0.01）；与单纯佛波酯组比较，rTIMP-1+佛波酯组中性粒细胞中CD63蛋白阳性表达率及细胞培养上清液中HBP、MPO蛋白表达水平均明显下降（ t值分别为5.26、2.83、1.26， P<0.05或 P<0.01）。 结论:严重烧伤患者休克期血浆中HBP表达水平增加；HBP可在体外诱导HUVEC分泌TIMP-1，TIMP-1可降低人中性粒细胞CD63分子表达。

目的:探究负压微环境对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）新生的影响及其机制。方法:采用实验研究方法。取第3~5代对数生长期HUVEC进行后续实验。取3批细胞，各批次细胞均分为常规培养24 h的正常对照组和单纯负压处理组以及加入17-丙烯胺基-17-去甲氨基格尔德霉素（17-AAG）培养24 h的单纯17-AAG组与17-AAG+负压处理组，另采用自行设计研发的全自动三维细胞梯度负压加载装置对2个负压处理组细胞行持续8 h的间歇负压吸引（负压值为-5.33 kPa，吸引30 s、暂停10 s），第1个批次细胞处理完成后于培养0（即刻）、24、48、72 h，采用细胞计数试剂盒8法检测细胞增殖水平，样本数为6；第2个批次细胞处理完成后进行划痕试验，于划痕后12 h，在倒置相差显微镜下观察细胞迁移情况后计算细胞迁移率，样本数为3；第3个批次细胞处理完成后进行小管形成实验，于培养6 h，在倒置相差显微镜下观察成管情况后计算细胞成管总长度与分支节点数，样本数为3。取细胞，分为正常对照组、单纯负压处理组、17-AAG+负压处理组，同前相应组别进行处理，处理完成后，采用蛋白质印迹法检测细胞中热休克蛋白90（HSP90）、窖蛋白1、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、eNOS磷酸化位点1177蛋白表达并计算eNOS磷酸化位点1177/eNOS比值（样本数为3），采用免疫共沉淀（共沉淀HSP90与窖蛋白1、窖蛋白1与eNOS）与蛋白质印迹法检测各组细胞中窖蛋白1、eNOS的蛋白表达（样本数为3），采用免疫荧光双重染色法评估细胞中HSP90与窖蛋白1、窖蛋白1与eNOS的蛋白共定位情况。通过HADDOCK 2.4蛋白质-蛋白质对接程序对窖蛋白1和eNOS进行分子对接预测。数据分析采用析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD法。结果:与正常对照组相比，单纯17-AAG组细胞增殖水平于处理完成后培养24、48、72 h均明显降低（ P<0.01），单纯负压处理组细胞增殖水平于处理完成后培养24、48、72 h均明显升高（ P<0.01）；与单纯17-AAG组相比，17-AAG+负压处理组细胞增殖水平于处理完成后培养48、72 h均明显升高（ P<0.05或 P<0.01）；与单纯负压处理组相比，17-AAG+负压处理组细胞增殖水平于处理完成后培养24、48、72 h均明显降低（ P<0.01）。划痕后12 h，与正常对照组的（39.9±2.7）%相比，单纯17-AAG组细胞迁移率明显降低［（10.7±2.7）%， P<0.01］，单纯负压处理组细胞迁移率明显升高［（61.9±2.4）%， P<0.01］；与单纯17-AAG组相比，17-AAG+负压处理组细胞迁移率明显升高［（37.7±3.7）%， P<0.01］；与单纯负压处理组相比，17-AAG+负压处理组细胞迁移率明显降低（ P<0.01）。处理完成后培养6 h，与正常对照组相比，单纯17-AAG组细胞成管总长度明显缩短（ P<0.05）且分支节点数明显减少（ P<0.05），单纯负压处理组细胞成管总长度明显延长（ P<0.01）且分支节点数明显增加（ P<0.01）；与单纯17-AAG组相比，17-AAG+负压处理组细胞成管分支节点数明显增加（ P<0.05）；与单纯负压处理组相比，17-AAG+负压处理组细胞成管总长度明显缩短（ P<0.01）且分支节点数明显减少（ P<0.01）。蛋白质印迹法检测显示，处理完成后，3组细胞中eNOS、窖蛋白1蛋白表达总体比较，差异均无统计学意义（ P>0.05）；单纯负压处理组细胞中HSP90蛋白表达与eNOS磷酸化位点1177/eNOS比值均明显高于正常对照组（ P<0.01），17-AAG+负压处理组细胞中HSP90蛋白表达与eNOS磷酸化位点1177/eNOS比值均明显低于单纯负压处理组（ P<0.01）。处理完成后免疫共沉淀与蛋白质印迹法检测显示，与正常对照组相比，单纯负压处理组细胞中窖蛋白1蛋白表达明显升高（ P<0.01），eNOS蛋白表达明显降低（ P<0.05）；与单纯负压处理组相比，17-AAG+负压处理组处理完成后细胞中窖蛋白1蛋白表达明显降低（ P<0.01），eNOS蛋白表达明显升高（ P<0.01）。处理完成后，与正常对照组相比，单纯负压处理组细胞中HSP90与窖蛋白1的蛋白共定位明显增多，窖蛋白1与eNOS的蛋白共定位明显减少；与单纯负压处理组比，17-AAG+负压处理组细胞中HSP90与窖蛋白1的蛋白共定位明显减少，窖蛋白1与eNOS的蛋白共定位明显增多。分子对接预测提示，窖蛋白1与eNOS相互作用较强，抑制eNOS 1177位点的磷酸化。 结论:负压微环境可能通过促进HUVEC中HSP90结合窖蛋白1进而抑制窖蛋白1结合eNOS，以解除窖蛋白1对eNOS 1177位点磷酸化的抑制，从而促进HUVEC增殖、迁移和成管，最终促进HUVEC新生。

目的:制备含氧化石墨烯（GO）的甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）水凝胶并探讨原位光聚合GO-GelMA复合水凝胶对小鼠全层皮肤缺损创面血管化的影响。方法:采用实验研究方法。将0.2 mg/mL的GO溶液50 μL均匀涂抹于导电胶上，烘干后于场发射扫描电子显微镜下观察GO的结构和大小。将人皮肤成纤维细胞（HSF）分为采用相应终质量浓度GO处理的0 μg/mL GO（不加GO溶液，下同）组、0.1 μg/mL GO组、1.0 μg/mL GO组、5.0 μg/mL GO组、10.0 μg/mL GO组，用酶标仪检测细胞培养48 h的吸光度值，以此表示细胞增殖活性（样本数为6）。将HSF和人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）分别分为采用相应终质量浓度GO处理的0 μg/mL GO组、0.1 μg/mL GO组、1.0 μg/mL GO组、5.0 μg/mL GO组，采用划痕试验检测划痕后24、36 h HSF的迁移率（样本数为5）及划痕后12 h HUVEC的迁移率（样本数为3），采用酶联免疫吸附测定法检测培养4、6、8 h后HSF分泌的血管内皮生长因子（VEGF）水平（样本数为3）。将配制的含相应终质量浓度GO的GO-GelMA复合水凝胶设为0 μg/mL GO复合水凝胶组、0.1 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组，观察其交联前后的性状，检测用磷酸盐缓冲液浸泡3、7 d后GO的释放情况（样本数为3）。在16只6周龄雌性C57BL/6小鼠背部制作全层皮肤缺损创面，将采用原位交联的含相应终质量浓度GO的GO-GelMA复合水凝胶处理的小鼠按随机数字表法分为0 μg/mL GO复合水凝胶组、0.1 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组，每组4只，观察治疗3、7、14 d创面大体情况并计算创面愈合率，采用激光多普勒血流仪检测治疗3、7、14 d创面血流灌注并计算平均灌注单位（MPU）比值，采用苏木精-伊红染色观察治疗7 d创面血管新生情况并计算血管密度（样本数均为3）。取0 μg/mL GO复合水凝胶组和0.1 μg/mL GO复合水凝胶组治疗7 d的创面组织，采用苏木精-伊红染色观察GO分布与血管新生的关系（样本数为3），行免疫组织化学染色后观察VEGF的表达。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析、Tukey法。结果:GO为多层片状结构，宽度约为20 μm、长度约为50 μm。培养48 h，10.0 μg/mL GO组HSF的吸光度值明显低于0 μg/mL GO组（ q=7.64， P<0.01）。划痕后24 h，4组HSF迁移率相近（ P>0.05）；划痕后36 h，0.1 μg/mL GO组HSF迁移率明显高于0 μg/mL GO组、1.0 μg/mL GO组、5.0 μg/mL GO组（ q值分别为7.48、10.81、10.20， P值均<0.01）。划痕后12 h，0.1 μg/mL GO组HUVEC迁移率明显高于0 μg/mL GO组、1.0 μg/mL GO组、5.0 μg/mL GO组（ q值分别为7.11、8.99、14.92， P值均<0.01），5.0 μg/mL GO组HUVEC迁移率明显低于0 μg/mL GO组和1.0 μg/mL GO组（ q值分别为7.81、5.33， P<0.05或 P<0.01）。培养4、6 h，4组HSF的VEGF表达均相近（ P>0.05）；培养8 h，0.1 μg/mL GO组HSF的VEGF表达明显高于0 μg/mL GO组和5.0 μg/mL GO组（ q值分别为4.75、4.48， P值均<0.05）。4组GO-GelMA复合水凝胶在交联前均呈红色液体状，交联后呈微黄色凝胶状且流动性无明显差异。0 μg/mL GO复合水凝胶组复合水凝胶各时间点均无GO释放，其余3组GO-GelMA复合水凝胶中的GO于浸泡3 d部分释放，至浸泡7 d全部释放。治疗3~14 d，4组小鼠创面可见水凝胶敷料覆盖在位并保持湿润，创面逐渐愈合。治疗3、7、14 d，4组小鼠创面愈合率均相近（ P>0.05）。治疗3 d，0.1 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面MPU比值明显高于0 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组（ q值分别为10.70、11.83、10.65， P<0.05或 P<0.01）。治疗7、14 d，4组小鼠创面MPU比值均相近（ P>0.05）。0.1 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面治疗7 d的MPU比值明显低于治疗3 d（ q=14.38， P<0.05），治疗14 d的MPU比值明显低于治疗7 d（ q=27.78， P<0.01）。治疗7 d，0.1 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面新生血管密度为每200倍视野下（120.7±4.1）根，明显高于0 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组的每200倍视野下（61.7±1.3）、（77.7±10.2）、（99.0±7.9）根（ q值分别为12.88、7.79、6.70， P值均<0.01）；1.0 μg/mL GO复合水凝胶组和5.0 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面新生血管密度均明显高于0 μg/mL GO复合水凝胶组（ q值分别为5.10、6.19， P<0.05）。治疗7 d，相较于0 μg/mL GO复合水凝胶组，0.1 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面中成簇新生血管更多，且聚集于GO附近；0.1 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面中GO和新生血管分布区域有大量VEGF表达。 结论:GO质量浓度低于10.0 μg/mL对HSF增殖活性无明显影响，0.1 μg/mL的GO能够促进HSF和HUVEC迁移，能促进HSF分泌VEGF。原位光聚合GO-GelMA复合水凝胶敷料能够通过促进小鼠全层皮肤缺损创面血管新生，增加创面早期血流灌注，且GO对新生血管有富集作用，其机制可能与GO促进创面细胞分泌VEGF相关。