目的:探讨全反式维甲酸(ATRA)调控Kruppel因子5(Klf5)在预防移植静脉术后狭窄的作用及机制。方法:建立新西兰大白兔(海军军医大学动物实验中心提供)静脉动脉化动物模型，按完全随机分为造模组(A、B、C组分别为饲养2、4、8周)和ATRA组(D、E、F组分别为饲养2、4、8周，鼻饲ATRA10 mg/d)、空白对照组(G组)，各6只。分别获取移植静脉标本，行苏木精-伊红染色及免疫组化检验。建立人脐静脉平滑肌细胞(SMC)KLF5过表达细胞模型，以ATRA干预，划痕实验、细胞增殖实验(CCK-8)明确SMC增殖及迁移情况；免疫共沉淀明确ATRA对Klf5-RARa结合的阻断作用。两组间计量资料采用两独立样本 t检验，多组间计量资料采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD- t检验方法。 结果:各组管径：A组(107.58±18.11) μm，B组(144.65±26.10) μm，C组(160.28±28.06) μm，D组(78.42±9.00) μm，E组(102.75±16.47) μm，F组(117.47±38.06) μm，G组(35.73±6.04) μm。组间比较，建模组各组(A、B、C各组)明显高于空白对照组(G组)( t＝5.81、8.81、10.08， P<0.01)，同期建模组各组明显高于ATRA组( t＝2.06、2.96、3.03， P<0.05)。以染色指数法计算免疫组化结果，建模各组细胞核增殖抗原(Ki-67，2周3.07±0.64，4周3.67±0.81，8周1.93±0.41)表达明显高于对照组( t＝6.93、9.37、4.16， P<0.01)，也高于同期ATRA组(2周2.87±0.52，4周3.60±1.21，8周2.10±0.24， t＝4.91、6.66、2.14， P<0.05)。实验组Klf5表达(2周4.43±0.70，4周5.67±1.18，8周3.03±0.98)明显高于对照组( t＝7.27、9.09、3.83， P<0.01)，建模组与ATRA组间KLF5(2周4.43±0.70，4周5.67±1.18，8周3.03±0.98)表达差异无统计学意义( t＝0.49、0.17、0.42， P>0.05)。CCK-8实验：72 h Klf5组吸光度( A)值(1.54±0.20)高于其余3组( t＝5.62、5.84、8.31， P<0.01)，Klf5+ATRA组(1.02±0.14)高于ARTA组(0.80±0.07， t＝2.47， P<0.05)，对照组(1.04±0.13)高于ATRA组( t＝2.70， P<0.05)。划痕实验：以迁移前后划痕距离的比值，klf5组0.098±0.006，对照组0.404±0.009，ATRA组0.597±0.014，Klf5+ATRA 0.265±0.012，组间比较ATRA组高于其余3组( t＝4.81、6.12、8.41， P<0.01)，Klf5组低于其余3组( t＝-8.37、-10.16、-12.25， P值均<0.01)。免疫共沉淀发现Klf5-RARa可以结合形成复合物，以不同浓度ATRA电泳 A值进行统计分析，50 μmol/ml组 A值(1.38±0.15)及70 μmol/ml组 A值(1.19±0.12)明显低于其余各组(对照组1.88±0.16、10 μmol/ml组1.81±0.10、30 μmol/ml组1.76±0.13， t＝-5.60、-5.10、-4.80、-7.10、-6.80、-6.40， P<0.01)。 结论:ATRA可以通过对KLF5-RARa结合的阻断作用来抑制平滑肌细胞增殖及迁移，进而预防静脉移植术后血管狭窄。

目的:探讨IL-6诱导人脐动脉平滑肌细胞（HUASMC）成骨样分化及钙化的跨膜信号转导机制。方法:体外培养HUASMC，分别给予IL-6、IL-6+可溶性IL-6受体（sIL-6R）、IL-6+sIL-6R+可溶性gp130（sgp130）刺激，设空白对照。茜素红及Von Kossa染色检测钙化水平，免疫印迹检测钙化相关分子组织非特异性碱性磷酸酶（TNAP）、骨桥蛋白（OPN）、骨形态发生蛋白（BMP-2）及Runt相关转录因子2（Runx2）表达，免疫荧光检测膜型IL-6R（mIL-6R）表达。计量资料组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD- t检验。 结果:IL-6+sIL-6R组钙化染色较其他组增多，IL-6+sIL-6R+sgp130组较IL-6组及空白组增多。蛋白印迹结果显示，干预12 h，TNAP蛋白表达量：空白组（0.44±0.08)、IL-6组（0.52±0.14）、IL-6+sIL-6R组（0.84±0.16）、IL-6+sIL-6R+sgp130组（0.55±0.10），各组差异具有统计学意义（ F=290.96， P<0.001）；干预72 h，OPN蛋白的表达量：空白组（0.61±0.84）、IL-6组（0.95±0.16）、IL-6+sIL-6R组（1.65±0.24）、IL-6+sIL-6R+sgp130组（0.99±0.10），各组差异具有统计学意义（ F=507.72， P<0.001）。干预12 h，BMP-2蛋白的表达量：空白组（(0.77±0.05）、IL-6组（1.69±0.16）、IL-6+sIL-6R组（2.81±0.26）、IL-6+sIL-6R+sgp130组（0.57±0.12），各组差异具有统计学意义（ F=959.09， P<0.001）；干预72 h，Runx2蛋白的表达量：空白组（0.57±0.03）、IL-6组（0.92±0.10）、IL-6+sIL-6R组（1.31±0.13）、IL-6+sIL-6R+sgp130组（0.66±0.06），差异具有统计学意义（ F=1 141.27， P<0.001）。IL-6+sIL-6R组中TNAP、OPN、BMP-2、Runx2的表达均高于其他组。免疫荧光结果显示HUASMC少量表达mIL-6R。 结论:IL-6可能主要通过sIL-6R介导的反式信号通路诱导HUASMC成骨样分化和钙化。

目的:探讨微小RNA(miRNA，miR)-30a通过诱导血管内皮细胞间质化(EndMT)，促进血管内膜增生，影响下肢动脉硬化闭塞症(ASO)进程。方法:苏木精-伊红染色法(HE)检测ASO病变动脉形态、内膜中膜厚度；免疫荧光检测EndMT标志物表达。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)处理人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，构建EndMT细胞模型。将体外培养的HUVECs分为转染miR阴性对照(miR-NC组)和转染miR模拟物(miR-30a组)。实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)、蛋白质印迹法(Western blot)检测EndMT标志物表达。细胞增殖实验检测HUVECs(EndMT)增殖能力、小室细胞迁移实验、划痕实验检测其迁移能力。采用GraphPad Prism 7进行统计学分析， t检验分析实验结果。 结果:ASO动脉内膜增生且呈间质化改变[内膜厚度，对照组(178.40±29.61) μm，ASO (422.10±39.47) μm， t＝4.940， P<0.01， n＝6；中膜厚度，对照组 (315.80±48.46) μm，ASO (656.80±43.91) μm， t＝5.200， P<0.01， n＝6]，差异有统计学意义，miR-30a在HUVECs(EndMT)和ASO内膜中高表达，miR-30a表达上调能够抑制HUVECs的内皮标志物表达，同时促进其间质标志物表达[CD31，对照：3.535±0.116，miR-30a：1.360±0.185， t＝9.966， P<0.01， n＝3；人血管内皮钙黏蛋白(VE-Cadherin)，对照：2.453±0.075，miR-30a：0.793±0.106， t＝12.830， P<0.01， n＝3；α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，对照：0.792±0.121，miR-30a：6.296±0.380， t＝13.820， P<0.01， n＝3；Ⅰ型胶原(COL1)，对照：0.2413±0.063，miR-30a：2.859±0.142， t＝16.840， P<0.01， n＝3]，差异有统计学意义，并促进HUVECs(EndMT)的增殖迁移能力[细胞迁移率，对照：(50.160±1.210)%，miR-30a：(68.560±1.918)%， t＝8.115， P<0.01， n＝6]，差异有统计学意义。 结论:miR-30a在ASO增生内膜中表达上调，miR-30a能够诱导内皮细胞间质化，增强其增殖迁移能力，导致ASO内膜增生、促进ASO病情进展。

目的:探究类泛素蛋白FAT10对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的血管内皮炎症因子释放的作用机制。方法:选取雄性16周龄WKY大鼠3只和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、人乳腺癌细胞（MDA-MB-231）、人血管平滑肌细胞（VSMC）。使用Western blot检测大鼠胸主动脉、颈动脉、肾动脉以及上述细胞中FAT10的表达。使用HUVEC细胞筛选FAT10表达量最高时AngⅡ的浓度及作用时间。构建空白对照质粒、过表达FAT10质粒、无效干扰质粒及干扰FAT10质粒，使用上述质粒转染HUVEC细胞。在加入100 nmol/L AngⅡ培养36 h后，采用Western blot 检测炎症因子单核细胞趋向性蛋白-1（MCP-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的蛋白表达水平；采用激光共聚焦显微镜检测细胞内活性氧生成水平；对转染空白对照质粒和过表达FAT10质粒的细胞应用活性氧清除剂N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC），采用Western blot检测应用或不应用NAC时MCP-1、TNF-α蛋白的表达水平。结果:FAT10在正常血压大鼠的颈动脉、胸主动脉、肾动脉以及HUVEC、VSMC、MDA-MB-231细胞系中均有表达。在HUVEC中，随着AngⅡ作用时间及浓度增加，FAT10的表达量逐渐增高，且在100 nmol/L AngⅡ作用36 h时达最高（ P<0.01）。在AngⅡ诱导下，过表达FAT10的HUVEC中炎症因子MCP-1（ P<0.001）与TNF-α的蛋白表达显著增加（ P<0.01），干扰FAT10的HUVEC中MCP-1与TNF-α的蛋白表达降低（ P均<0.001）。过表达FAT10的HUVEC中活性氧生成水平增加（ P<0.001），干扰FAT10的HUVEC中活性氧生成水平降低（ P<0.05）。应用NAC后，过表达FAT10的HUVEC中炎症因子MCP-1与TNF-α的蛋白表达升高趋势被逆转（ P均<0.05）。 结论:FAT10通过增加细胞内活性氧生成水平而促进AngⅡ诱导的内皮细胞炎症因子释放。

目的:研究Ⅰ、Ⅳ fimA型牙龈卟啉单胞菌脂多糖（ Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide，Pg-LPS）对共培养条件下人脐动脉平滑肌细胞（human umbilical artery smooth muscle cell，HUASMC）增殖和迁移能力的影响，探讨牙周炎与动脉粥样硬化（atherosclerosis，As）相关的生物学基础和机制。 方法:厌氧培养Ⅰ、Ⅳ fimA型Pg，分别提取、纯化并鉴定两型Pg-LPS；体外原代培养人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）和HUASMC，并采用鼠尾Ⅰ型胶原建立HUVEC-HUASMC共培养细胞模型；实验分为T1组（质量浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L的ⅠfimA型Pg-LPS刺激共培养细胞）和T2组（质量浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L的ⅣfimA型Pg-LPS刺激共培养细胞），以及阴性对照组（不加LPS组）；细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）法检测HUASMC的增殖能力，Transwell迁移小室观察HUASMC的迁移能力。比较各组不同质量浓度Pg-LPS刺激共培养细胞2、8、24及48 h后，HUASMC的增殖及迁移能力的变化。结果:共培养细胞在Ⅰ、Ⅳ fimA型Pg-LPS的作用下，在24及48 h时，两型Pg-LPS的各质量浓度组中，HUASMC的 A值均较阴性对照组显著上调（ P<0.05）；在48 h时5.0、10.0 mg/L ⅣfimA型Pg-LPS 刺激共培养细胞后，HUASMC的 A值（分别为1.386±0.044、1.455±0.058）均显著高于相同浓度ⅠfimA型Pg-LPS刺激共培养中HUASMC的 A值（分别为1.168±0.064、1.204±0.088）（ P<0.05）；此外，在48 h时，5.0、10.0 mg/L Ⅳ fimA型Pg-LPS 刺激共培养细胞后，HUASMC的 A值均显著高于0.5、1.0 mg/L Ⅳ fimA型Pg-LPS 刺激共培养中HUASMC的 A值（分别为1.170±0.082、1.239±0.089）（ P<0.05）。HUASMC的迁移结果显示，在8、24及48 h时，Ⅰ、ⅣfimA型Pg-LPS各质量浓度组中，HUASMC的迁移数量均较同组内2 h时相同Pg-LPS质量浓度下HUASMC迁移数量显著上调（ P<0.05）；在48 h时，除10.0 mg/L ⅣfimA型Pg-LPS外，其余各Pg-LPS质量浓度组HUASMC的迁移数量均较同组内24 h时相同Pg-LPS质量浓度下HUASMC迁移数量显著增加（ P<0.05）；且在48 h时，2.0 mg/L Ⅳ fimA型Pg-LPS刺激共培养细胞后，HUASMC的迁移数量（204.00±20.98）较相同浓度下Ⅰ fimA型Pg-LPS刺激后HUASMC迁移数量（141.89±18.28）显著上调（ P<0.05）；在同一观察时点，同型Pg-LPS浓度越高，HUASMC的迁移数量越多（ P<0.05）。 结论:Ⅰ、ⅣfimA型Pg-LPS均能促使共培养细胞中HUASMC的增殖和迁移能力增强；Pg-LPS的毒力与其fimA基因型相关，ⅣfimA型Pg-LPS较ⅠfimA型Pg-LPS刺激作用更显著，更易导致HUASMC功能紊乱，从而为重度牙周炎更易促进As的进展提供依据。

目的:探讨miR-133a-3p修饰的人源脐带血间充质干细胞（ucMSC）衍生的外泌体对急性心肌梗死（AMI）后大鼠心肌修复的作用。方法:体外扩增培养ucMSC，将携带miR-133a-3p的慢病毒载体及阴性对照载体分别转染至ucMSC，分别提取其分泌的外泌体，命名为miR-133a-3p-Exo及miR-NC-Exo。采用冠状动脉左前降支结扎术构建大鼠AMI模型，分别于梗死区边缘原位注射miR-133a-3p-Exo或miR-NC-Exo进行干预。干预后28 d，采用超声心动图检测大鼠心功能；采用Masson染色检测大鼠梗死后心肌纤维化面积；采用TUNEL染色评估梗死后大鼠心肌凋亡情况；采用免疫荧光染色评估梗死后大鼠血管新生情况。结果:与miR-NC-Exo组相比，miR-133a-3p-Exo组在AMI后28 d左心室射血分数较高［（64.2%±8.9%）比（47.4%±9.8%）， P<0.05］，心肌纤维化面积［（18.0%±1.5%）比（31.2%±7.3%）， P<0.01］和凋亡率［（15.1%±4.4%）比（25.6%±3.6%）， P<0.05］较低；梗死边缘区血小板-内皮黏附因子（CD31）及平滑肌肌动蛋白（α-SMA）阳性血管的数量均较多［CD31：（13.9±2.0）条比（2.9±0.9）条，α-SMA：（11.0±1.6）条比（3.5±0.9）条， P均<0.000 1］。 结论:miR-133a-3p修饰的ucMSC分泌的外泌体可有效抑制梗死后心肌凋亡、促进梗死后血管新生，从而改善AMI后大鼠的心功能。

目的:利用实时细胞电子分析技术(real-time cell-based assay, RTCA)检测不同浓度复方丹参片对细胞的影响，筛选出对复方丹参片反应灵敏、稳定且有明显浓度依赖的细胞株，为复方丹参片进行细胞生物效应的质量评价提供实验依据。方法:采用RTCA分析复方丹参片对人脐静脉内皮细胞(Huvec)、大鼠心肌细胞(H9C2)和大鼠胸主动脉平滑肌细胞(RA-VSMC)的影响，形成时间剂量依赖性细胞反应曲线，测定细胞指数，筛选最优的细胞株。结果:3种细胞对复方丹参片的效应均有明显反应，RA-VSMC的灵敏度相对较差，3种细胞的有效浓度范围也有差异，浓度梯度依赖性也各有不同。H9C2细胞对复方丹参片具有良好的敏感度，呈浓度梯度依赖，且有效浓度范围为0.3～1.8 mg/ml，可作为复方丹参片质量评价的细胞。结论:RTCA技术可实时监测记录细胞生长状态，准确反映复方丹参片对不同细胞株的影响，数据客观可靠，为复方丹参片的质量评价研究提供了新的实验技术和方法。

目的:探讨低氧预处理人脐带间充质干细胞来源的外泌体(hUCMSC-Exos)对低氧性肺动脉高压(HPH)肺血管内皮-间充质转化(EndMT)的影响.方法:(1)用组织块贴壁法分离培养原代hUCMSCs,用超滤法提取hUCMSC-Exos并鉴定.(2)将24只SPF级雄性SD大鼠随机分为常氧(N)组、低氧(H)组、低氧+常氧hUCMSC-Exos组和低氧+低氧预处理hUCMSC-Exos组,每组6只.H组及各干预组大鼠置于模拟海拔5 000 m低氧环境的低压氧舱中,并于低氧第3、5、7、10和14天经尾静脉注射常氧hUCMSC-Exos、低氧预处理hUCMSC-Exos或等体积PBS.造模21 d后检测各组大鼠右心室收缩压(RVSP)和右心室肥厚指数(RVHI),HE染色观察肺组织病理改变.(3)将人肺小动脉内皮细胞(HPAECs)饥饿12 h后随机分为常氧对照(N-Con)组、低氧模型(H-Con)组、低氧+常氧hUCMSC-Exos组和低氧+低氧预处理hUCMSC-Exos组.Transwell实验和小管形成实验检测HPAECs迁移和小管形成能力;免疫荧光双染法检测HPAECs中CD31和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达;Western blot法检测肺血管和HPAECs中CD31、VE-cadherin、α-SMA和vimentin蛋白水平.结果:(1)低氧21 d可成功构建HPH大鼠模型,且肺血管发生EndMT.与N组相比,H组大鼠RVSP、RVHI、血管壁面积占血管总面积的百分率(WA%)和血管壁厚度占血管外径的百分率(WT%)显著升高(P＜0.01),肺血管管壁增厚,且肺血管中CD31和VE-cadherin蛋白表达显著减少(P＜0.01),α-SMA和vimentin蛋白表达显著增加(P＜0.05或P＜0.01).与H组相比,经常氧或低氧预处理hUCMSC-Exos干预后大鼠RVSP、RVHI、WA%和WT%显著降低(P＜0.05或P＜0.01),肺血管重构减轻,且低氧预处理hUCMSC-Exos显著抑制HPH肺血管重构和EndMT的形成.(2)低氧处理HPAECs 48 h可诱导细胞发生迁移、小管形成和End-MT.与H-Con组相比,经低氧预处理hUCMSC-Exos干预后细胞迁移和小管形成显著减少(P＜0.01),CD31和VE-cadherin蛋白表达显著增多(P＜0.05或P＜0.01),α-SMA和vimentin蛋白表达显著减少(P＜0.01).结论:低氧预处理hUCMSC-Exos通过抑制肺血管EndMT而缓解HPH肺血管重塑.

[目的]探讨剪切修复基因D(XPD)在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)促血管平滑肌细胞增殖中的作用及分子机制.[方法]将重组质粒pEGFP-N2/XPD利用脂质体转染人脐静脉平滑肌细胞(HUVSMC),沉默哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因,用MTT、EdU法测定各组细胞的增殖;流式细胞仪检测各组凋亡率;利用Western blot检测XPD、血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1(LOX-1)、mTOR、p-mTOR、Bcl-2及Bax的表达.[结果]与对照组比较,ox-LDL组XPD表达明显下调(P＜0.05),Bax蛋白表达下调(P＜0.05),Bcl-2蛋白、Bcl-2/Bax、mTOR磷酸化活性及LOX-1蛋白表达升高(P＜0.05);MTT、BdU结果显示,ox-LDL组细胞增殖较对照组上调(P＜0.05).转染pEGFP-N2/XPD重组质粒能上调Bax蛋白表达(P＜0.05)并抑制Bcl-2蛋白、mTOR磷酸化活性及LOX-1蛋白表达(P＜0.05),Bcl-2/Bax比值下调(P＜0.05);流式细胞仪检测结果显示,转染pEGFP-N2/XPD重组质粒后,细胞凋亡率较对照组增加(P＜0.05);MTT、BdU结果显示,转染pEGFP-N2/XPD重组质粒后,细胞增殖较对照组下调(P＜0.05).沉默mTOR基因后,与对照组相比,siRNA mTOR组HUVSMC中LOX-1蛋白表达被抑制(P＜0.05).[结论]XPD能抑制HUVSMC的增殖并且促进其凋亡,下调mTOR和LOX-1蛋白表达,抑制ox-LDL的促HUVSMC增殖和抗凋亡作用,有可能成为抗动脉粥样硬化治疗的靶点.

目的 从人脐静脉内皮细胞(HUVECs)外泌体及人主动脉血管平滑肌细胞(HAVSMCs)表型转化角度探讨温心方治疗冠心病的可能作用机制.方法 30只SD大鼠给予温心方水煎剂33.75 g/(kg·d)灌胃,连续7天,末次灌胃2 h后腹主动脉取血制备含药血清.取对数生长期的HUVECs,分别设立对照组、模型组及温心方高、中、低剂量组,对照组使用完全培养基培养,温心方高、中、低剂量组分别用5％、15％、25％温心方含药血清培养24 h后加入50 mg/L氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)培养24h,模型组仅加入50mg/L ox-LDL培养24h造模.各组高速离心分离获取HUVECs外泌体,透射电镜观察外泌体形态,BCA法测定外泌体蛋白浓度,检测外泌体粒径,Western Blot法检测外泌体标志蛋白溶酶体相关膜蛋白3(CD63)、肿瘤易感基因101(TSG101)表达,qRT-PCR法检测外泌体miR-145表达.各组HUVECs外泌体50 ng与HAVSMCs共培养24h,观察外泌体摄取,于6、12、24、48 h应用MTT法检测HAVSMCs细胞增殖率,Transwell法检测细胞迁移能力,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western Blot法检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌22α蛋白(SM22α)、骨桥蛋白(OPN)水平.结果 成功提取HUVECs外泌体,在镜下可见HAVSMCs细胞摄取HUVECs外泌体.模型组HUVECs外泌体中CD63、TSG101及miR-145表达较对照组显著减少(P＜0.01),温心方组各剂量组CD63、TSG101及miR-145表达较模型组显著升高,且温心方高剂量组在升高CD63、miR-145方面优于温心方低、中剂量组(P＜0.05或P＜0.01).各组外泌体与HAVSMCs共培养后,与对照组比较,模型组HAVSMCs细胞增殖率、细胞凋亡率增加,细胞迁移个数增多,α-SMA、SM22α蛋白表达降低、OPN升高(P＜0.05或P＜0.01);与模型组比较,温心方各剂量组在24、48 h时细胞增殖率及细胞凋亡率均降低,12、24、48 h时细胞迁移个数减少,α-SMA、SM22α表达升高,OPN表达降低(P＜0.05或P＜0.01);与温心方中、低剂量组比较,温心方高剂量组在24、48 h细胞增殖率降低,在12、24、48 h细胞迁移个数降低,α-SMA、SM22α表达升高,OPN表达降低(P＜0.05).结论 温心方含药血清可通过促进HUVECs外泌体释放,抑制HAVSMCs表型转化,减轻细胞增殖迁移,从而发挥治疗冠心病作用.