目的:探讨莪术醇通过磷酯酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路对神经胶质瘤增殖、凋亡的作用机制。方法:不同浓度莪术醇(0、25、50、100、200 μmol/L)干预人脑星形胶质母细胞瘤细胞(U87MG)，观察细胞生长；细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞活力。将对数生长期U87MG细胞接种于裸鼠尾状核部位，建立胶质瘤原位模型。将模型裸鼠随机分组为模型组(等体积生理盐水)、莪术醇低剂量组(20 mg/kg)、中剂量组(40 mg/kg)和高剂量组(80 mg/kg)，每组10只，连续灌胃治疗3周。观察各组小鼠行为变化；计算相对肿瘤体积、相对抑瘤率；苏木精-伊红(HE)染色观察瘤组织病理；免疫组织化学法(IHC)分析原位瘤增殖细胞核抗原(PCNA)表达及肿瘤细胞增殖指数；原位缺口末端标记法(TUNEL)染色分析肿瘤细胞凋亡水平；蛋白质印迹法(Western blot)分析PI3K/Akt信号通路相关蛋白及下游细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、B淋巴细胞瘤-2(bcl-2)、bcl-2相关X蛋白(bax)蛋白表达。两组间差异比较采用独立样本 t检验，多组间差异比较采用One-way ANOVA分析。 结果:不同浓度莪术醇干预U87MG细胞后，随着给药浓度增加细胞出现漂浮碎片，凋亡细胞数增多；CCK-8结果显示，细胞存活率分别为对照组(1.00±0.07)%，25 μmol/L组(1.10±0.04)%，50 μmol/L组(0.67±0.04)%，100 μmol/L组(0.58±0.06)%，200 μmol/L组(0.24±0.01)%，各给药组的细胞存活率均低于对照组，差异有统计学意义( F＝323.402， P<0.05)。计算瘤体体积及抑瘤率结果显示，模型组瘤体体积(42.50±27.78) mm 3，各治疗组瘤体体积及抑瘤率分别为低剂量组[(31.85±20.89) mm 3，25.20%]，中剂量组[(21.49±13.42) mm 3，49.54%]，高剂量组[(13.73±12.0) mm 3，67.75%]，各治疗组瘤体体积均小于模型组，差异有统计学意义( F＝2.147， P<0.05)，高剂量组瘤体体积明显小于模型组[(13.73±12.05) mm 3比(42.50±27.78) mm 3， t＝2.130， P<0.05]。IHC结果显示，对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量肿瘤细胞增殖指数分别(16.67±1.52)%、(40.00±1.73)%、(33.67±2.52)%、(25.67±4.17)%、(18.00±2.64)%，各治疗组肿瘤细胞增殖指数均低于模型组，差异有统计学意义( F＝32.607， P<0.05)，高剂量组肿瘤细胞增殖指数明显低于模型组[(18.00±2.64)%比(40.00±1.73)%， t＝12.050， P<0.05]。TUNEL染色结果显示对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组肿瘤细胞凋亡率分别为(65.80±4.37)%、(13.47±1.87)%、(23.13±4.17)%、(38.57±5.85)%、(53.00±5.70)%，各治疗组肿瘤细胞凋亡率均高于模型组，差异有统计学意义( F＝60.625， P<0.05)，高剂量组肿瘤细胞凋亡率明显高于模型组[(53.00±5.70)%比(13.47±1.87)%， t＝－11.398， P<0.05]。Western blot结果显示，对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组PI3K、Akt蛋白相对表达量分别为(0.10±0.01、0.72±0.06)、(0.49±0.02、1.94±0.69)、(0.39±0.01、1.69±0.17)、(0.32±0.05、1.41±0.28)、(0.14±0.03、1.11±0.28)，各治疗组PI3K、Akt相对表达量均低于模型组，差异有统计学意义( F＝3.150、17.944， P<0.05)，高剂量组PI3K、Akt表达量均明显低于模型组[(0.14±0.03、1.11±0.28)比(0.49±0.02、1.94±0.69)， t＝2.823、4.973， P<0.05]；增殖相关蛋白Cyclin D1在对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组中相对表达量分别为0.33±0.07、1.12±0.08、0.89±0.14、0.71±0.10、0.50±0.10，各治疗组Cyclin D1相对表达量均低于模型组，差异有统计学意义( F＝27.851， P<0.05)，高剂量组Cyclin D1表达量明显低于模型组(0.50±0.10比1.12±0.08， t＝8.010， P<0.05)；凋亡相关蛋白bcl-2、bax在对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量中相对表达量分别(0.42±0.02、0.95±0.08)、(1.18±0.15、0.42±0.11)、(0.96±0.16、0.51±0.13)、(0.72±0.08、0.62±0.09)、(0.57±0.08、0.73±0.10)，各治疗组bcl-2表达低于模型组，bax表达高于模型组，差异有统计学意义( F＝23.907、11.864， P<0.05)，高剂量组bcl-2表达明显低于模型组(0.57±0.08比1.18±0.15， t＝6.391， P<0.05)，高剂量组bax表达明显高于模型组(0.73±0.10比0.42±0.11， t＝－3.663， P<0.05)。 结论:莪术醇可以显著抑制胶质瘤细胞增殖，并促进其凋亡；机制可能是通过调控PI3K/Akt信号通路发挥抗肿瘤作用。

目的 建立重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)感染细胞后目的蛋白表达水平的检测方法,并进行方法验证,以期用于rAAV9生产过程中不同阶段产物的质量监控.方法 将rAAV9供试品用感染增强剂Envirus-AAV处理后,感染经羟基脲(hydroxyurea,HU)作用的人脑星形胶质母细胞瘤细胞U87-MG,以rAAV9参考品为标准,采用ELISA法检测细胞中目的蛋白戊二酰辅酶A脱氢酶(glutaryl-CoA dehydrogenase,GCDH)的表达水平,并验证方法的专属性、准确性、精密性、线性范围、定量限及耐用性.采用建立的方法检测8批rAAV9供试品.结果 供试品缓冲液的A45.-A63.为0.3,略低于蛋白定量四参数标准曲线最低稀释点(1 ng/mL);150％、100％、50％理论相对效价水平样品平均回收率均在100.0％～107.3％范围内;同1名实验员重复3次及不同实验员检测3个理论相对效价水平样品的目的蛋白表达水平RSD均＜25％;rAAV9供试品在50％～150％理论相对效价水平范围内,与相应的目的蛋白表达水平呈良好的线性关系,直线回归方程为y=1.077 x-0.022,R2为0.984;方法的定量限为0.59,即6.0× 1012 vg/mL;U87-MG细胞用HU孵育不同时间(18、21、24 h)、细胞培养上清液于不同条件(室温放置0.5 h、-60 ℃以下放置12 h、-60 ℃以下放置24 h)保存后,目的蛋白表达水平RSD均＜25％.1～8批rAAV9供试品目的蛋白表达水平分别为 111％、121％、72％、65％、86％、75％、102％、91％.结论 建立的rAAV感染细胞后目的蛋白表达水平检测方法具有良好的专属性、准确性、精密性及耐用性,可用于rAAV9生产过程中不同阶段产物的质量监控.

目的 探讨黑骨藤对高表达表皮生长因子(EGF)受体突变体Ⅲ(EGFRvⅢ)的人胶质母细胞瘤细胞DKMG的影响及其机制.方法 取对数生长期的 DKMG 和不表达 EGFRvⅢ的人脑星形胶质母细胞瘤细胞U87MG,各自分为空白(Con)组(DMEM培养液)、低浓度黑骨藤组(100 mg/L黑骨藤培养液)、中浓度黑骨藤组(200 mg/L黑骨藤培养液)及高浓度黑骨藤组(400 mg/L黑骨藤培养液),处理细胞 24 h,采用细胞增殖与毒力检测试剂盒(MTS)检测各组DKMG、U87MG细胞的存活率,采用流式细胞术检测各组DKMG细胞凋亡率;实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(qRT-PCR)检测各组DKMG细胞中EGFRvⅢ、B淋巴细胞瘤-2 基因(Bcl-2)及BCL2-Associated X(Bax)的信使核糖核酸(mRNA)表达,采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组DKMG细胞中EGFRvⅢ、Bcl-2、Bax、半胱氨酸蛋酶家族(Caspase-3、Cleaved caspase-3)蛋白的表达.结果 MTS检测显示,与Con组相比,各浓度黑骨藤组DKMG细胞存活率明显降低(P＜0.05),各浓度黑骨藤组U87MG细胞存活率比较、差异无统计学意义(P＞0.05);流式细胞术结果表明,与Con组比较,各浓度黑骨藤组DKMG细胞凋亡率明显增加(P＜0.05);qRT-PCR结果表明,与Con组比较,各浓度黑骨藤组DKMG细胞中EGFRvⅢ和Bcl-2 mRNA表达降低(P＜0.05),Bax 表达无变化(P＞0.05);Western blot 结果显示,各浓度黑骨藤组 DKMG 细胞中EGFRvⅢ、Bcl-2 及Caspase-3 蛋白表达下降(P＜0.05),Bax、Cleaved caspase-3 蛋白表达升高(P＜0.05).结论 黑骨藤可诱发DKMG细胞凋亡,产生细胞杀伤作用,其机制可能与下调EGFRvⅢ、Bcl-2、Caspase-3 表达及上调Bax、Cleaved caspase-3 表达有关.

目的:采用免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)、Sanger测序法分别对中枢神经系统肿瘤患者异柠檬酸脱氢酶1(isocitrate dehydrogenase 1,IDH1)基因进行突变检测,并对结果的一致性进行分析,为临床IDH1基因突变检测方法的选择提供指导依据.方法:运用IHC和Sanger测序法检测657例人脑胶质瘤及其他中枢神经系统肿瘤中IDH1基因突变.结果:IHC检测结果:657例样本中,230例发生IDH1基因突变,49例组织为少量阳、弱阳等可疑阳性;Sanger测序法检测发现255例存在IDH1基因突变,11例因DNA质量不佳无法获得可评估结果.IHC与Sanger测序法检测IDH1基因突变具有较好的一致性(Kappa=0.88),差异无统计学意义(P=0.49);IDH1基因突变主要发生在WHOⅡ～Ⅲ级的星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、间变星形细胞瘤、间变少突胶质细胞瘤以及WHOⅣ级的继发性胶质母细胞瘤中.结论:IHC检测IDH1基因突变的结果与Sanger测序法检测结果具有较好的一致性,IHC敏感性低于Sanger测序法,但特异性较高,且操作相对简单,适于临床普遍开展和推广;Sanger测序法敏感性高,可检测未知突变位点,IHC检测突变阴性及不确定的病例应进一步使用Sanger测序法验证.

用PCR-SSCP及DNA直接测序研究了44例人脑胶质瘤。发现13例有P53基因突变。33例星形细胞瘤12例有P53基因突变。11例非星形细胞瘤1例有P53基因突变。DNA直接测序证实所有突变均在P53基因第5～8外显子，发现了一些新的突变位点，并发现在3例胶质母细胞瘤中存在P53基因的多个位点的突变。该结果提示在大多数非星形细胞胶质瘤并不涉及P53基因突变，P53基因突变对星形细胞瘤的诊断有重要价值。特别是多位点的P53基因突变可做为星形细胞瘤进展到胶质母细胞瘤的基因标志。

以直接制片法分析13例人脑胶质瘤实体瘤的染色体。11例获得分裂相，其中9例星形细胞瘤，其染色体数目畸变为20号，16号，7号，1号和8号的丢失及22号，21号和14号的增多，并发现1条具有均匀染色区（HSR）的结构异常的染色体；1例髓母细胞瘤以亚四倍体为主，数目畸变为5号，9号，17号，18号，20号等的丢失及11号，13号，14号的增多；1例复发性脉络膜乳头状瘤以亚二倍体为主，见到1条异常染色体。

目的 构建不同培养模式的血脑屏障(BBB)体外细胞模型并进行结构和功能的比较和分析.方法 用人脑微血管内皮细胞系(hCMEC/D3)、人脑星形胶质母细胞瘤细胞系(U87MG)和人脑血管周细胞系(HBVP)3种细胞在Transwell装置中构建细胞模型.根据细胞种类和细胞位置的不同,将模型分为单培养、双培养(hCMEC/D3+U87MG或HBVP)、不接触共培养、半接触共培养和全接触共培养5种血脑屏障体外细胞模型.检测模型的通透性和渗透性以及相关蛋白和基因的表达,比较不同模型的结构和功能特点并分析.结果 与单培养和双培养模型相比,共培养模型的渗透性降低,紧密性升高,血脑屏障相关的基因和蛋白的表达也升高(P<0.05).在共培养模型中,半接触和全接触培养模型具有更低的渗透性(P<0.001),全接触细胞培养模型的紧密性更高(P<0.01),部分血脑屏障相关蛋白和基因的表达也更高(P<0.05).结论 全接触共培养细胞模型具有更优的血脑屏障相关性质,更适用于血脑屏障研究.

本文报道一例人脑多形性胶质母细胞瘤细胞系“BT325”的建立及其生物学特性，至今已传180代，维持4年以上，生长稳定，每周传代一次，细胞形态多样，呈球状，双极形，星形及少量多核巨细胞。透射电镜可见多量微管及束状微丝。异种移植至裸鼠皮下生长肿瘤，病理切片经HE、PTAH及Foot's染色均证实为恶性胶质瘤。免疫化学染色胶质纤维酸性蛋白（GFAP）呈阳性反应，生长曲线计算倍增时间为36.5小时，染色体组型显示亚四倍体，90%以上显示有标记染色体。细胞周期时相分析用FCM法计算出各时相的百分比为G 1=52.94%，S=28.08%，G 2+M=18.98%，用PLM法计算出各时相的时间为Tc=37.5小时、TG 1=16.2小时，Ts=10.5小时，TG 2+M=10.8小时，TM估计值为0.8小时，细胞冻融存活率为77%左右，认为本系细胞生长和特性稳定，可作筛选化疗药物，有一定帮助。

目的 探讨脑胶质瘤患者中ATRX失表达与P53过表达的相关性,并分析二者与临床多因素在胶质瘤诊断及预后中的意义.方法 收集2014年1月—2020年12月徐州医科大学附属医院神经外科收治的术后病理诊断为胶质瘤的患者92例,其中包括星形细胞瘤(WHO Ⅱ、Ⅲ级)30例、少突胶质细胞瘤(WHO Ⅱ、Ⅲ级)50例、胶质母细胞瘤(WHO Ⅳ级)12例,并使用免疫组织化学染色法检测ATRX与P53表达情况,并统计不同年龄、性别与二者间的关系;x2检验分析ATRX失表达、P53过表达与不同病理类型脑胶质瘤的关系且二者表达之间的关系用Spearman等级相关分析法检验;Kaplan-Meier生存曲线分析二者对胶质瘤患者预后的影响,其他临床因素纳入多因素Cox回归分析.结果 ATRX与P53表达与胶质瘤病理类型相关(P＜0.05);相关性分析显示,胶质瘤中ATRX与P53表达呈负相关(r=-0.580,P＜0.01);多因素分析表明,胶质瘤患者的年龄≥60岁、病理分级WHO Ⅲ-Ⅳ级、术前KPS评分＜60分、术后无放化疗、肿瘤直径≥5 cm、肿瘤非全切、ATRX失表达、P53过表达是预后不良的独立危险因素(P＜0.05).结论 在人脑胶质瘤患者中,ATRX失表达与P53过表达密切相关,与临床其他多因素联合可更好地对胶质瘤患者的预后进行评估.

目的:构建钯负载氧化石墨(GO@Pd)纳米酶,探究其类酶活性对脑胶质细胞凋亡的影响.方法:通过原位生长法合成GO@Pd纳米酶并进行表征;体外检测GO@Pd的类超氧化物歧化酶(SOD)活性、类过氧化物酶(POD)活性和消耗谷胱甘肽(GSH)的能力;并利用亚甲基蓝检测其羟基自由基(·OH-)的生成;通过细胞增殖试剂盒评价GO@Pd的体外生物安全性;分别将Pd、GO和GO@Pd与人脑星形胶质母细胞瘤(U-118MG)细胞共同孵育,利用DCFH-DA荧光探针检测各组细胞内活性氧(ROS)水平;通过线粒体膜电位染色检测各组细胞内线粒体膜电位变化.结果:经一系列材料表征表明成功制备了大小均一、分散性良好的GO@Pd纳米酶;类酶活性检测结果显示,GO@Pd同时拥有类SOD和类POD双重类酶活性,并且可以催化H2O2生成·OH-和消耗GSH;当GO@Pd浓度在0～100μg/mL之间,C8-D1A细胞的活率保持在90％以上;与空白对照组相比,GO@Pd组的U-118MG细胞内ROS水平显著升高(P<0.001),并且其线粒体膜电位染色结果红色/绿色荧光强度比值显著降低(P<0.0001).结论:成功制备了具有双重酶样活性的GO@Pd纳米酶,且其可以通过促进胶质瘤细胞内ROS生成,诱导线粒体损伤,从而引发胶质瘤细胞凋亡.