松墨天牛Monochamus alternatus是我国南方林区重要的蛀干害虫,也是我国重大林业外来入侵物种松材线虫Bursaphelenchus xylophilus的主要传播媒介.为探究热激蛋白HSP40在松墨天牛抵御高温胁迫中的功能,基于松墨天牛转录组数据(GenBank登录号:PRJNA548205),通过RT-PCR技术克隆两条松墨天牛HSP40基因,并对其进行生物信息学分析;使用MEGA 7.0软件构建松墨天牛HSP40系统进化树;利用RT-qPCR技术检测16日龄松墨天牛雌雄成虫各组织HSP40基因在不同温度与时间处理条件(35℃、37℃、40、42.5℃和45℃;0h、1 h、2 h和3 h)下和高温42.5℃处理3 h后的组织表达特性.结果表明:克隆获得松墨天牛两条HSP40基因MaltHSP40-l(GenBank 登录号:MW690168)和 MaltHSP40-2(GenBank 登录号:MW690169),其 ORF 长度分别为1 206 bp和1 059 bp,分别编码401个和352个氨基酸,分子质量分别约为45.24 kDa和39.25 kDa,等电点分别为6.73和9.07;两条序列中均存在含有保守的HPD基序以及DNA-J结构域;蛋白三维结构中均由N端的4个a螺旋和C端的底物结合域构成.系统进化树显示:MaltHSP40-1和MaltHSP40-2分别与光肩星天牛Anoplophora glabripennis的AglaHSP40-1和AglaHSP40-2遗传距离最近.RT-qPCR结果显示,高温胁迫可诱导松墨天牛HSP40基因的转录表达,雌雄成虫的MaltHSP40-1和MaltHSP40-2分别在35℃和37.5℃的条件下开始表达上调,在40℃或42.5℃时到达峰值,雄虫HSP40的相对表达量和上调倍数均高于雌虫;MaltHSP40-1及MaltHSP40-2在松墨天牛雌雄成虫的各组织中均有表达,42.5℃处理3 h后,MaltHSP40-l及MaltHSP40-2在各组织中的相对表达量均显著上调,精巢和卵巢中相对表达量最高.本研究表明McdltHSP40-l和MaltHSP40-2作为辅助分子伴侣,参与松墨天牛抵御高温胁迫.研究结果有助于深入探究热激蛋白在松墨天牛应对高温胁迫中的作用,也为揭示气候变暖背景下松墨天牛及松材线虫病的流行成灾机理提供理论依据.

水平基因转移(horizontal gene transfer,HGT)是生物体获得遗传信息的方式之一,对生物体进化起重要作用.近年来,越来越多昆虫中的水平基因转移现象被报道,如在鳞翅目(如家蚕、甜菜夜蛾、小菜蛾、斜纹夜蛾)、半翅目(如柑橘粉蚧、烟粉虱)、鞘翅目(如咖啡果小蠹、米象、光肩星天牛)、膜翅目(如金小蜂)、双翅目(如果蝇、白纹伊蚊)等昆虫中广泛存在水平转移基因,且不同的水平转移基因对昆虫的营养合成与共生、吸收与消化、毒素产生与解毒、生长和发育、体色改变等方面有着重要作用.本文结合国内外专家学者的相关报道,就HGT的研究步骤与技术方法、评判HGT发生的方法、昆虫HGT的供体与功能几个方面进行了总结和讨论,以期更加深入地了解水平基因转移现象,为探究水平基因转移的作用机制、理解昆虫的进化、遗传和行为、并将水平基因转移应用到农业生产中为农业害虫的绿色防治提供更多思路.

长期以来,一些林业本地害虫和外来入侵害虫对我国森林生态系统造成了严重损害或威胁,而天敌昆虫作为一类有效的自然调控因子,对这些害虫的种群抑制发挥了重要作用.本文以日本松干蚧、松突圆蚧、湿地松粉蚧、美国白蛾、椰心叶甲、红脂大小蠹6种重要入侵种以及杨圆蚧、白蜡窄吉丁、松墨天牛、光肩星天牛、栗山天牛、松毛虫等多种本地重要害虫为例,介绍了近50年来利用天敌昆虫进行生物防治的研究状况,对我国林业害虫生物防治实践中存在的问题进行了分析,并对未来天敌昆虫资源的开发与利用等方面进行了展望.

[目的]Mfe2 为过氧化物酶体多功能酶类型2 (peroxisomal multifunctional enzyme type 2) 基因,在脂肪酸的β 氧化中起到了极其重要的作用.本研究旨在获得和鉴定松墨天牛Monochamus alternatus 的Mfe2 基因,原核表达其编码蛋白,并分析其在该虫不同虫态和成虫不同组织中的表达模式.[方法]采用在载体与目的片段之间设计具有重叠区引物的快速克隆方法克隆松墨天牛 Mfe2 基因,并对克隆所得序列进行生物信息学分析; IPTG 诱导原核表达,并以Western blot 结果验证Mfe2 基因表达的融合蛋白的成功表达; 使用RT-qPCR 技术分析这一基因在天牛不同虫态和成虫不同组织中的表达谱.[结果]克隆到松墨天牛Mfe2 基因,并命名为MaMfe2(GenBank 登录号: MF944109),其ORF 序列全长为2 148 bp,编码716 个氨基酸,预测分子量大小为77. 56 kD.生物信息分析显示,MaMfe2 具有AICARFT _ IMPCHas 保守结构域序列,与光肩星天牛Anoplophora glabripennis 过氧化物酶体多功能酶2 氨基酸序列一致性最高(为91％).Western blot 检测显示大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3) 中MaMfe2 表达的蛋白与抗体有特异性结合.发育表达谱结果表明,MaMfe2 在松墨天牛蛹期表达量最高,在卵和幼虫期表达量较低; 组织表达谱结果表明,在成虫不同组织中,MaMfe2 在脂肪体中表达量最高,在前胸中表达量最低.[结论]松墨天牛Mfe2 基因 MaMfe2 编码过氧化物酶体多功能酶,在不同虫态和成虫组织中存在差异表达.本研究为进一步探究该基因在松墨天牛中的功能奠定了基础.

释放肿腿蜂是控制天牛的环境友好型生物防治方法之一.为评价松褐天牛肿腿蜂Sclerodermus sp.对悬铃木上天牛的防治效果,首先调查明确了荆州城区危害悬铃木的天牛种类主要为光肩星天牛,其幼虫和成虫数量分别占天牛总数量93.78％和95.45％;室内测定结果显示蜂虫比2∶1、1∶1、1∶2时光肩星天牛3个龄期幼虫寄生死亡率分别为86.67％、76.30％、33.34％;野外释放寄生蜂60 d后释放点天牛虫口减退率为52.79％-81.85％.研究结果表明,人工释放松褐天牛肿腿蜂能够有效控制悬铃木上天牛种群.

[目的]松墨天牛Monochamus alternatus是我国南方松林中的重要蛀干害虫, 也是林业检疫性病害——松材线虫病的主要媒介昆虫, 其分布范围较广, 对温度的适应性强, 本研究旨在初步探讨松墨天牛对温度胁迫适应性的分子机制.[方法]采用RT-PCR与RACE技术克隆松墨天牛小热激蛋白 (small heat shock protein, sHSP) 基因的全长cDNA, 结合生物信息学方法分析小热激蛋白的结构特征;利用qPCR技术测定该基因在松墨天牛不同发育阶段、4龄幼虫不同组织及不同低温和高温胁迫下4龄幼虫中的表达谱, 并用geNorm, NormFinder和BestKeeper软件对不同温度下内参基因稳定性进行评价.[结果]获得松墨天牛sHSP基因的cDNA全长序列, 命名为MaltHSP21.20 (GenBank登录号:MH091811), 全长为871 bp, 编码187个氨基酸, 信号肽预测表明其N末端含有18个氨基酸的信号肽, 成熟蛋白预测分子质量为21.20 kD, 等电点为8.65.结构域预测符合小热激蛋白家族的特征, 共含有10个β折叠片, 在α结构域内含有7个β折叠片.进化树分析表明该蛋白氨基酸序列与光肩星天牛Anoplophora glabripennis的sHSP有较高的同源性.不同软件分析得到最稳定的内参基因存在差异, 结合3种方法评价得出RPL10最为稳定.MaltHSP21.20在不同发育阶段的松墨天牛体内均有表达, 滞育幼虫中表达量最高, 卵期及蛹期表达量次之;在4龄幼虫不同组织中均有分布, 脂肪体中表达量最高;4龄幼虫MaltHSP21.20对低温诱导无响应, 其表达量在35℃时显著上调, 45℃处理2和3 h最高, 50℃时下降.[结论]RPL10是不同温度胁迫下较稳定的内参基因.相比其他热激蛋白基因, MaltHSP21.20对低温敏感性较低, 推测其在幼虫滞育越冬及抵抗高温中发挥重要作用.

[目的]丝氨酸蛋白酶 (serine protease, SP) 是一类以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶.本研究旨在克隆获得沙葱萤叶甲Galeruca daurica丝氨酸蛋白酶基因, 分析其对温度胁迫的响应, 以期为进一步揭示沙葱萤叶甲耐温性的调控机制及其他生理功能奠定基础.[方法]根据沙葱萤叶甲2龄幼虫转录组数据, 采用RACE技术克隆得到沙葱萤叶甲丝氨酸蛋白酶基因的cDNA全长序列, 并进行生物信息学分析;应用qPCR技术检测其在不同温度 (-10,-5, 0, 5, 25和35℃) 下处理1 h后及25℃下恢复30 min后在沙葱萤叶甲2龄幼虫中的表达量变化.[结果]自沙葱萤叶甲克隆获得一个丝氨酸蛋白酶基因, 命名为GdSP (GenBank登录号:MG797556).该基因全长1 110 bp, 开放阅读框969 bp, 编码322个氨基酸;蛋白预测分子量35.41 kD, 等电点5.61;编码蛋白具有丝氨酸蛋白酶的典型特征, 具有一个跨膜结构, 无信号肽.同源序列比对和系统发育分析表明, GdSP与光肩星天牛Anoplophora glabripennis SP的同源性最高, 氨基酸序列一致性为30.53％.qPCR测定结果表明, 不同温度处理间2龄幼虫中GdSP表达量差异不显著, 但对各高低温 (-10℃除外) 胁迫处理回温后GdSP表达量显著上升.[结论]快速冷驯化对沙葱萤叶甲丝氨酸蛋白酶基因表达无显著影响, 而回温可诱导其上调表达.

[目的]探究光肩星天牛Anoplophoraglabripennis(ALB)在吉林珲春的耐寒性,为实现在当地释放花绒寄甲Dastarcus helophoroides防治ALB提供理论基础.[方法]于吉林珲春采集被ALB危害的杨树木段,室内解剖木段后收集各虫态/龄期ALB,并测量这些天牛的过冷却点.通过设置同一时间(0.5 h)下0、4和8 ℃不同驯化温度和最适驯化温度下0.5、1和4h不同驯化时间,以明确花绒寄甲成虫的过冷却能力受驯化温度和驯化时间的影响.将上述两组数据进行综合,分析ALB大幼虫与不同冷驯化条件下花绒寄甲成虫过冷却点的相关性.[结果]ALB卵(分布在树皮表层)的过冷却点最低,随着其不断发育并向树内蛀食,其过冷却点逐渐升高,即不同虫态/龄期的过冷却点大小顺序为卵＜小幼虫(100 mg以下)＜大幼虫(500 mg以上).花绒寄甲成虫的过冷却能力受低温驯化影响明显,4 ℃条件下冷驯化0.5 h时最易提高其耐寒性.ALB大幼虫的过冷却点显著高于0(0.5 h)、4(0.5 h)、8(0.5 h)和4 ℃(1h)冷驯化条件下处理的花绒寄甲成虫.[结论]ALB能以高于当地最低温的过冷却点越冬,除受自身耐寒能力影响外,还与所处微生境有关.而花绒寄甲成虫在经历一定时间的快速冷驯化处理后,过冷却点显著降低,耐寒性得到明显提高.表明吉林珲春等高纬度地区利用花绒寄甲防治ALB存在较大的可行性.

杨树是我国"三北"地区防护林建设的主栽树种,自20世纪70年代以来长期受到光肩星天牛的严重危害.北抗杨对光肩星天牛有一定的抗性,但产生抗性的生化机制尚不清楚.本研究采用试剂盒法与高效液相色谱法以未受害、机械损伤、虫害北抗杨为研究材料,对其树皮和木质部中的次生代谢产物和防御酶含量进行检测,以探索其抗性机制.结果 表明,北抗杨受到机械损伤和光肩星天牛危害后其反应不同:1)次生代谢产物,北抗杨受到机械损伤后,树皮中的水杨苷和白杨甙含量显著上升,槲皮苷含量降低;而受光肩星天牛危害后,树皮中的水杨苷和槲皮苷含量显著上升,白杨甙含量无显著变化.机械损伤的北抗杨木质部总酚含量高于虫害与未受害木质部,后两者间无显著差异;光肩星天牛危害的北抗杨木质部白杨甙和亚麻木酚素含量高于机械损伤木质部与未受害木质部.遭受机械损伤与虫害后北抗杨木质部的总酚苷含量显著高于未受害木质部.2)防御酶活性分析表明,与未受害北抗杨树皮相比,受到机械损伤与虫害后的树皮苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性显著升高,但两者间无差异;受到机械损伤与虫害后的树皮超氧化物歧化酶(SOD)活性高于未受害树皮,且机械损伤树皮高于虫害树皮;北抗杨受机械损伤与虫害后木质部中的过氧化物酶(POD)活性高于未受害木质部,但两者间无差异.3)与未受害北抗杨相比,北抗杨受机械损伤、虫害后部分次生代谢物和防御酶都有不同程度的增加,推测这些物质可能与北抗杨抗逆性反应有关.

光肩星天牛Anoplophora glabripennis和星天牛Anoplophora chinensis是我国两种重要的林业蛀干害虫,存在很多共同的寄主植物.为了阐明两种星天牛之间的物种竞争关系,本文采用行为观察试验,研究两种星天牛寄主危害部位、异种危害寄主识别和种间争斗行为等试验.结果显示,光肩星天牛和星天牛在寄主植物上的取食危害部位有很大差异,光肩星天牛主要取食寄主植物的枝条上部,取食面积为2390.0 mm2,占整个寄主植物取食面积的69.3％,星天牛主要取食寄主植物的树干上部,取食面积为3140.0 mm2,占整个寄主植物的96.6％;两种星天牛都能识别异种天牛危害过的寄主,对其具有显著的回避性,其中光肩星天牛对星天牛危害过的寄主取食量平均值为420.8 mm2,显著低于健康寄主取食量平均值2518.8 mm2,同样,星天牛对光肩星天牛危害过的寄主取食量平均值为436.8 mm2,显著低于健康寄主取食量平均值1803.5 mm2,而对同种天牛危害过的寄主没有显著的选择性;两种星天牛之间争斗共发生34次,其中星天牛获胜30次,表现出更强的竞争力.两种星天牛之间存在显著的种间竞争关系,并且能够识别对方物种的存在,其对寄主的感受机制和植物免疫反应机制需要进一步的试验研究.