松墨天牛Monochamus alternatus是我国南方林区重要的蛀干害虫,也是我国重大林业外来入侵物种松材线虫Bursaphelenchus xylophilus的主要传播媒介.为探究热激蛋白HSP40在松墨天牛抵御高温胁迫中的功能,基于松墨天牛转录组数据(GenBank登录号:PRJNA548205),通过RT-PCR技术克隆两条松墨天牛HSP40基因,并对其进行生物信息学分析;使用MEGA 7.0软件构建松墨天牛HSP40系统进化树;利用RT-qPCR技术检测16日龄松墨天牛雌雄成虫各组织HSP40基因在不同温度与时间处理条件(35℃、37℃、40、42.5℃和45℃;0h、1 h、2 h和3 h)下和高温42.5℃处理3 h后的组织表达特性.结果表明:克隆获得松墨天牛两条HSP40基因MaltHSP40-l(GenBank 登录号:MW690168)和 MaltHSP40-2(GenBank 登录号:MW690169),其 ORF 长度分别为1 206 bp和1 059 bp,分别编码401个和352个氨基酸,分子质量分别约为45.24 kDa和39.25 kDa,等电点分别为6.73和9.07;两条序列中均存在含有保守的HPD基序以及DNA-J结构域;蛋白三维结构中均由N端的4个a螺旋和C端的底物结合域构成.系统进化树显示:MaltHSP40-1和MaltHSP40-2分别与光肩星天牛Anoplophora glabripennis的AglaHSP40-1和AglaHSP40-2遗传距离最近.RT-qPCR结果显示,高温胁迫可诱导松墨天牛HSP40基因的转录表达,雌雄成虫的MaltHSP40-1和MaltHSP40-2分别在35℃和37.5℃的条件下开始表达上调,在40℃或42.5℃时到达峰值,雄虫HSP40的相对表达量和上调倍数均高于雌虫;MaltHSP40-1及MaltHSP40-2在松墨天牛雌雄成虫的各组织中均有表达,42.5℃处理3 h后,MaltHSP40-l及MaltHSP40-2在各组织中的相对表达量均显著上调,精巢和卵巢中相对表达量最高.本研究表明McdltHSP40-l和MaltHSP40-2作为辅助分子伴侣,参与松墨天牛抵御高温胁迫.研究结果有助于深入探究热激蛋白在松墨天牛应对高温胁迫中的作用,也为揭示气候变暖背景下松墨天牛及松材线虫病的流行成灾机理提供理论依据.

[目的]探究马尾松健康植株不同位置挥发性物质,比较其不同部位的挥发物的种类差异及含量,分析松墨天牛成虫对健康马尾松各部位挥发物的触角电位反应和嗅觉反应,为开展松墨天牛的行为调控技术提供依据.[方法]采用静态顶空法和气相色谱-质谱联用技术分析了马尾松松针、1 cm枝条、5 cm枝条、20 cm树干、30 cm树干、松油脂6个部位的挥发物,并对松墨天牛雌雄成虫进行触角电位测定和行为反应观测.[结果]6个部位的挥发物提取物中,共检测出36种挥发性物质,各部位挥发物种类相近,相对含量差异较大,但其主要挥发物均为萜烯类物质,主要包括月桂烯、蒎烯、左旋-beta-蒎烯、莰烯等.在触角电位试验中,5 cm枝条挥发物提取物的触角电位值最高,松油脂挥发物提取物的触角电位值最高;在行为反应试验中,各部位挥发物对松墨天牛成虫均有一定的引诱作用,其中雌成虫对5 cm枝条挥发物提取物的趋向性最高,雄成虫对30 cm树干和松油脂挥发物提取物的趋向性最高.[结论]健康状态下,马尾松5 cm枝条及30 cm树干和松油脂中萜烯类挥发物制成的植物源引诱剂对松墨天牛两性成虫具有更好的引诱作用,这将为提高现有的诱捕剂效果提供参考,同时为松墨天牛虫害防治提供科学依据.

[目的]探究松墨天牛Monochamus alternatus雌成虫卵巢发育过程,从日龄的角度对松墨天牛卵巢发育进行分级,并且判断引诱剂野外诱捕雌成虫的发育状态,为松墨天牛高效防控提供参考.[方法]对达到0,5,10,15,20,30,40和15日龄交配前后的松墨天牛雌成虫以及引诱剂诱集雌成虫进行生物解剖,观察卵巢发育状态.[结果]松墨天牛雌成虫卵巢发育过程分为5级:发育前期(0-5日龄):卵巢管透明纤细,无卵黄沉积;卵黄沉淀期(5-15日龄):卵巢管内含有少数乳白色和淡黄色未成熟的卵粒;卵巢成熟期(15-20日龄):卵巢管内包含大量完全成熟的卵粒,呈长纺锤形,黄色饱满有光泽;产卵盛期(20-40日龄):输卵管萼中堆满成熟卵粒,中输卵管和侧输卵管中存在待产的卵粒;衰老期(≥40日龄):卵巢管、输卵管萼和输卵管逐渐萎缩.交配后的雌成虫能够产生受精卵,输卵管萼膨大、形态清晰;未交配的雌成虫无法产生受精卵,卵粒堆积在输卵管中无法产出,输卵管萼未分化完全、形态不清晰.野外诱集结果显示,诱集的不同 日龄的雌成虫量具有显著性差异,其中处于产卵盛期的雌成虫占比最多,占总量的54.90％±5.50％;卵巢成熟期、衰老期和卵黄沉淀期的雌成虫占比较少,分别占总量的31.37％±5.52％,11.76％±1.54％和1.96％±0.51％;没有诱集到发育前期的雌成虫.[结论]松墨天牛雌成虫发育至15-20日龄达到性成熟;交配行为能够促进松墨天牛雌成虫卵巢发育.引诱剂可以诱捕到大量刚性成熟的松墨天牛成虫,对于减少松墨天牛产卵量,降低下一代发生基数,降低松材线虫Bursaphelenchus xylophilus传播几率具有积极意义.

[目的]探究被松墨天牛Monochamus alternatus携带的松材线虫Bursaphelenchus xylophilus对松墨天牛肠道和气管细菌的影响.[方法]野外采集携带松材线虫的松墨天牛成虫后,取出完整肠道和气管进行细菌总DNA抽提后进行16S rDNA基因测序并拼接,并利用生物信息学方法分析松墨天牛成虫肠道和气管细菌组成、结构、丰度和多样性.[结果]携带松材线虫的松墨天牛成虫肠道和气管细菌菌群共检测到15门26纲66目110科201属296种,可操作分类单元(operational taxonomic unit,OTU)数目为444.携带松材线虫的松墨天牛成虫比未携带松材线虫的松墨天牛成虫肠道优势细菌菌群变化不显著,均为变形菌门(Proteobacteria)肠杆菌目(Enterobacterales);携带松材线虫的松墨天牛成虫气管优势细菌菌群为变形菌门肠杆菌目,未携带松材线虫的松墨天牛成虫气管优势细菌菌群为厚壁菌门(Firmicutes)乳杆菌目(Lactobacillales).携带松材线虫的松墨天牛成虫较未携带松材线虫的松墨天牛成虫气管细菌多样性和丰度升高,细菌群落结构显著不同;携带松材线虫的松墨天牛成虫肠道和气管中沙雷氏菌属Serratia和肠杆菌属Enterobacter富集.[结论]携带松材线虫后对松墨天牛成虫气管细菌菌群组成、结构、丰度和多样性都有显著影响,携带松材线虫的松墨天牛成虫气管中的沙雷氏菌属和肠杆菌属可能与松材线虫-松墨天牛复合体有紧密的联系.在携带松材线虫后,松墨天牛成虫气管中沙雷氏菌属增加,可能与松墨天牛气管免疫受抑制有关.本研究为解析松墨天牛肠道和气管细菌多样性提供了理论基础,为防控松材线虫提供了新的方向.

[目的]明确松墨天牛Monochamus alternatus内生殖系统的结构及发育过程,为松墨天牛生殖机理研究及种群动态监测提供理论依据.[方法]选择不同日龄的松墨天牛雌雄成虫,采用组织解剖学方法结合光学显微镜对内生殖系统进行观察,明确其结构特征;通过发育级别划分,确定雌雄成虫内生殖系统的发育过程.[结果]松墨天牛雌成虫内生殖系统由1对卵巢、1对侧输卵管、中输卵管、交配囊、受精囊管、受精囊、受精囊腺、产卵器和生殖腔组成.根据雌成虫卵巢管和受精囊腺的形态和颜色将雌成虫性成熟发育过程划分为:乳白透明期(Ⅰ级)、卵黄沉积初期(Ⅱ级)、卵黄沉积盛期(Ⅲ级)和卵成熟待产期(Ⅳ级).卵巢管在卵巢发育过程中不断增长,颜色由乳白透明转为黄色,受精囊腺的形态和颜色从扁平、半透明到饱满、黄色.雄成虫内生殖系统由1对精巢、2对附腺、1对输精管、1对贮精囊、1对射精管、环状器和阳茎组成.根据雄成虫精巢叶、贮精囊和附腺的形态和颜色将雄虫性成熟发育过程划分为:乳白透明期(Ⅰ级)、精子形成初期(Ⅱ级)、精子形成盛期(Ⅲ级)和成熟期(Ⅳ级).精巢叶长径变化较小,精巢管、贮精囊和环状器颜色由乳白半透明到白色,附腺形态和颜色由细小半透明到膨大透明.松墨天牛雌、雄成虫的内生殖系统发育主要集中在Ⅱ～Ⅲ级,就内生殖系统的发育进程而言,雄成虫发育速度更快,12日龄时内生殖系统已经发育成熟,而雌成虫在15日龄时内生殖系统发育成熟.[结论]明确了松墨天牛雌、雄成虫内生殖系统基本结构及其发育进程,不仅为进一步研究松墨天牛生殖机理提供了理论依据,还为生产实践中松墨天牛产卵高峰期的预测预报提供参考.

[目的]云南松Pinus yunnanensis Franch是我国西南地区重要的生态林造林树种之一.钻蛀性害虫松墨天牛Monochamus alternatus Hope、几种切梢小蠹Tomicus spp.、微红梢斑螟Dioryctria rubella Hampson和一种病害松针褐斑病Lecanosticta acicola能在云南松人工林内严重发生,对森林健康构成威胁.本研究选取树冠枯梢率作为云南松树势的评价标准,筛选出引起树冠枯梢的主要因子,建立云南松树冠受害表征与不同种类(数量)有害生物复合危害之间的关系,以期探索对云南松有害生物进行遥感监测预警的精准判别方法.[方法]设置标准地,抽样选择35株受害状为局部枝梢枯萎和29株系统性萎蔫的云南松,分别调查其上有害生物的种类和数量.使用Pearson相关性分析等方法研究云南松枯梢率与各致害因子(松墨天牛、切梢小蠹、微红梢斑螟和松针褐斑病)之间的关系.通过多元线性逐步回归的方法,筛选出导致云南松树冠局部枯梢的主要因子,建立枯梢率关于主要有害生物种群数量的反演模型.[结果]局部枝梢枯萎植株的树冠枯梢率与两种切梢小蠹的种群数量均呈高度正相关,与树木胸径和其他致害因子呈较弱或无相关性.分析标准地每木调查结果发现,树冠有无病梢不能显著影响枯梢率情况.建立了通过枯梢率(Y)反演云南松树冠两种切梢小蠹混合种群数量(X)的回归模型:Y=12.0984+0.9835 X,Adj-R2=0.8081.明确了在蛀梢阶段,云南松树势随着切梢小蠹种群数量上升而下降.在蛀干阶段,切梢小蠹和松墨天牛的钻蛀活动主要集中在濒死木和枯立木上.[结论]引起树冠局部枯梢、树势下降的主要因子为横坑切梢小蠹和云南切梢小蠹成虫的蛀梢活动;引起树冠系统性萎蔫、树木死亡的主要原因是松墨天牛与切梢小蠹的蛀干活动.应用本研究模型可通过判别云南松树冠枯梢率估算两种切梢小蠹在蛀梢期的混合种群数量,为航天遥感或无人机监测虫情提供可靠的理论基础.

[目的]松墨天牛是松树的重要蛀干害虫,也是林业重大外来入侵种松材线虫的媒介昆虫.虽然松墨天牛和松材线虫互作的化学生态和分子进化机制受到人们的广泛关注,但miRNA等表观遗传因子在天牛—线虫互作中的作用未见报道.[方法]使用illuminaHiSeq 2000平台进行miRNA高通量测序,得到4个携带线虫的天牛miRNA库和4个未携带线虫的天牛miRNA库.此外,对鉴定出的miRNA进行了差异表达分析,并对这些miRNA的靶基因进行了GO注释和KEGG通路富集分析.[结果]在携带线虫的天牛表皮、脂肪体、中肠和气管样本中分别鉴定出780、802、617和762个miRNA;在未携带松材线虫的天牛的不同组织样本中分别鉴定出784、723、713和837个miRNA.在携带松材线虫的松墨天牛中,某些已知miRNA表达量会显著升高,如miR-14、miR279和miR-312等.差异表达miRNA的功能大多指向代谢、免疫等方面.[结论]miRNA在松墨天牛和松材线虫互作中起着重要的调控作用.

长期以来,一些林业本地害虫和外来入侵害虫对我国森林生态系统造成了严重损害或威胁,而天敌昆虫作为一类有效的自然调控因子,对这些害虫的种群抑制发挥了重要作用.本文以日本松干蚧、松突圆蚧、湿地松粉蚧、美国白蛾、椰心叶甲、红脂大小蠹6种重要入侵种以及杨圆蚧、白蜡窄吉丁、松墨天牛、光肩星天牛、栗山天牛、松毛虫等多种本地重要害虫为例,介绍了近50年来利用天敌昆虫进行生物防治的研究状况,对我国林业害虫生物防治实践中存在的问题进行了分析,并对未来天敌昆虫资源的开发与利用等方面进行了展望.

[目的]Mfe2 为过氧化物酶体多功能酶类型2 (peroxisomal multifunctional enzyme type 2) 基因,在脂肪酸的β 氧化中起到了极其重要的作用.本研究旨在获得和鉴定松墨天牛Monochamus alternatus 的Mfe2 基因,原核表达其编码蛋白,并分析其在该虫不同虫态和成虫不同组织中的表达模式.[方法]采用在载体与目的片段之间设计具有重叠区引物的快速克隆方法克隆松墨天牛 Mfe2 基因,并对克隆所得序列进行生物信息学分析; IPTG 诱导原核表达,并以Western blot 结果验证Mfe2 基因表达的融合蛋白的成功表达; 使用RT-qPCR 技术分析这一基因在天牛不同虫态和成虫不同组织中的表达谱.[结果]克隆到松墨天牛Mfe2 基因,并命名为MaMfe2(GenBank 登录号: MF944109),其ORF 序列全长为2 148 bp,编码716 个氨基酸,预测分子量大小为77. 56 kD.生物信息分析显示,MaMfe2 具有AICARFT _ IMPCHas 保守结构域序列,与光肩星天牛Anoplophora glabripennis 过氧化物酶体多功能酶2 氨基酸序列一致性最高(为91％).Western blot 检测显示大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3) 中MaMfe2 表达的蛋白与抗体有特异性结合.发育表达谱结果表明,MaMfe2 在松墨天牛蛹期表达量最高,在卵和幼虫期表达量较低; 组织表达谱结果表明,在成虫不同组织中,MaMfe2 在脂肪体中表达量最高,在前胸中表达量最低.[结论]松墨天牛Mfe2 基因 MaMfe2 编码过氧化物酶体多功能酶,在不同虫态和成虫组织中存在差异表达.本研究为进一步探究该基因在松墨天牛中的功能奠定了基础.

[目的]松墨天牛Monochamus alternatus是我国南方松林中的重要蛀干害虫, 也是林业检疫性病害——松材线虫病的主要媒介昆虫, 其分布范围较广, 对温度的适应性强, 本研究旨在初步探讨松墨天牛对温度胁迫适应性的分子机制.[方法]采用RT-PCR与RACE技术克隆松墨天牛小热激蛋白 (small heat shock protein, sHSP) 基因的全长cDNA, 结合生物信息学方法分析小热激蛋白的结构特征;利用qPCR技术测定该基因在松墨天牛不同发育阶段、4龄幼虫不同组织及不同低温和高温胁迫下4龄幼虫中的表达谱, 并用geNorm, NormFinder和BestKeeper软件对不同温度下内参基因稳定性进行评价.[结果]获得松墨天牛sHSP基因的cDNA全长序列, 命名为MaltHSP21.20 (GenBank登录号:MH091811), 全长为871 bp, 编码187个氨基酸, 信号肽预测表明其N末端含有18个氨基酸的信号肽, 成熟蛋白预测分子质量为21.20 kD, 等电点为8.65.结构域预测符合小热激蛋白家族的特征, 共含有10个β折叠片, 在α结构域内含有7个β折叠片.进化树分析表明该蛋白氨基酸序列与光肩星天牛Anoplophora glabripennis的sHSP有较高的同源性.不同软件分析得到最稳定的内参基因存在差异, 结合3种方法评价得出RPL10最为稳定.MaltHSP21.20在不同发育阶段的松墨天牛体内均有表达, 滞育幼虫中表达量最高, 卵期及蛹期表达量次之;在4龄幼虫不同组织中均有分布, 脂肪体中表达量最高;4龄幼虫MaltHSP21.20对低温诱导无响应, 其表达量在35℃时显著上调, 45℃处理2和3 h最高, 50℃时下降.[结论]RPL10是不同温度胁迫下较稳定的内参基因.相比其他热激蛋白基因, MaltHSP21.20对低温敏感性较低, 推测其在幼虫滞育越冬及抵抗高温中发挥重要作用.