目的 探讨新型量子点荧光免疫层析法测定血清淀粉样蛋白A(SAA)的应用.方法 采用双抗夹心法结合量子点荧光免疫层析技术制备以二硝基苯酚(DNP)-牛血清白蛋白(BSA)系统为质控线的SAA检测试剂盒.通过鸡IgY-羊抗鸡IgY系统作为对照评价了 DNP-BSA系统作为质控线的可行性,并通过优化量子点微球与抗体的偶联条件,进一步提高试剂盒的性能,并对试剂盒的空白限、检出限、线性范围、精密度、准确度、特异度、稳定性,以及临床实际样本测定等方面进行了评价.结果 以DNP-BSA系统作为质控线的SAA试剂盒受干扰成分浓度的影响小,稳定性高,热稳定性好.量子点微球与SAA抗体偶联比例为100 μg/mg,偶联反应液浓度为25 mmol/L 3-吗啉丙磺酸pH 7.4,与DNP-BSA偶联比例为100 μg/mg,偶联反应液浓度为25 mmol/L吗啉乙磺酸pH 6.0时偶联效果最佳.试剂盒最低检出限为0.5 mg/L;线性范围为1～200 mg/L,R2≥0.99;批内精密度变异系数(CV％)≤5.31％,批间精密度CV％≤15％;在低、高浓度的回收率分别为101.42％、98.83％;在血红蛋白浓度≤5 g/L,胆红素浓度≤0.15 g/L,胆固醇浓度≤15 g/L,甘油三酯浓度10 g/L时,SAA的检测结果无干扰;试剂盒在50 ℃放置21 d,稳定性良好;试剂盒与Roche的SAA电化学发光试剂盒同步检测67例样本结果具有高度一致性.结论 研制的SAA检测试剂盒灵敏度、线性、精密度、准确度、特异度及加速稳定性都满足试剂盒的要求,与鸡IgY-羊抗鸡IgY系统相比DNP-BSA系统作为质控线独立性好,测定临床样本准确度和热稳定性更佳.

从药效相关性和成分差异阐释青翘与老翘改善博来霉素(BLM)诱导肺纤维化小鼠的作用差异.小鼠随机分为正常组,模型组,吡非尼酮组(50mg·kg-1),青翘低、高剂量组(1.3、2.6g·kg-1),老翘低、高剂量组(1.3、2.6 g·kg-1).采用气管滴注BLM制备肺纤维化模型,统计小鼠存活率及体质量变化;给药完成后计算肺指数,HE染色、Masson染色和天狼星红染色评价肺组织病理变化;透射电子显微镜观察肺组织超微结构;生化法测定肺组织转化生长因子-β1(TGF-β1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E钙黏着蛋白(E-cadherin)、羟脯氨酸(HYP)及肺泡灌洗液中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;RT-qPCR、Western blot法检测肺组织中基质金属蛋白酶7(MMP7)、胶原蛋白I型(collagen I)、E-cadherin、TNF-α、波形蛋白(vimentin)、TGF-β1、α-SMA表达;免疫荧光检测肺组织中α-SMA的表达;主成分分析法评价老翘与青翘改善肺纤维化的作用差异;分子对接技术分析老翘中含量高的化合物与TGF-β1受体之间的相互作用,CCK-8法检测其对TGF-β1诱导BEAS-2B和HFL1细胞模型的影响.结果显示,青翘、老翘可提高肺纤维化小鼠存活率,降低肺指数,改善肺组织病理损伤与胶原纤维沉积水平,改善小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞板层小体受损情况,降低肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α水平,下调肺组织中HYP、MMP7、vi-mentin、collagen Ⅰ、TGF-β1、α-SMA的表达,上调E-cadherin的表达.通过主成分分析综合评价胶原纤维沉积水平,其改善程度为老翘高剂量＞老翘低剂量＞青翘高剂量＞青翘低剂量.分子对接显示羟基酪醇、咖啡酸、连翘脂素、落叶松脂素与TGF-β1受体有较好的结合活性,且可显著减轻TGF-β1诱导BEAS-2B细胞损伤,抑制TGF-β1诱导HFL1细胞增殖.综上,青翘、老翘均可有效改善BLM诱导的肺纤维化小鼠损伤,老翘在减少胶原沉积方面优于青翘,可能与老翘中羟基酪醇、咖啡酸、连翘脂素、落叶松脂素含量高于青翘有关.

目的:探讨一种新型的糖尿病视网膜病变（DR）大鼠模型的建立及其病理特点。方法:取褐色挪威（BN）大鼠36只，分为对照组、链脲佐菌素（STZ）组和STZ+亚精胺（SP）组，每组12只。STZ组和STZ+SP组尾静脉注射STZ，STZ+SP组玻璃体注射亚精胺，对照组给与同体积的溶剂。造模后继续饲喂12周，期间监测体重和空腹血糖。利用超声成像系统观察视网膜中央动脉血流供应情况。动物处死后取眼球行苏木精-伊红染色，观察视网膜基本结构，分析各层厚度。视网膜消化铺片行过碘酸雪夫染色和神经胶质抗原2免疫荧光染色，观察微血管和周细胞情况。采用流式细胞术检测视网膜组织活性氧簇（ROS）水平；最后利用分子生物学技术检测紧密连接蛋白闭合蛋白-1（claudin-1）和咬合蛋白（occludin） mRNA和蛋白表达。多组重复测量的计量资料的比较采用重复测量的方差分析，组间两两比较采用LSD- t法。 结果:与对照组比较，STZ组和STZ+SP组大鼠体重下降（ P<0.05），血糖升高（ P<0.05）；与STZ组比较，STZ+SP组大鼠视网膜中央动脉舒张末期血流速度和收缩末期血流速度下降（ P<0.05），搏动指数和阻力指数则升高（ P<0.05）。病理学观察可见，STZ组和STZ+SP组大鼠神经细胞核层区排列疏松、紊乱，视网膜丛区水肿，且STZ+SP组表现的更为严重。与STZ组比较，STZ+SP组视网膜厚度和外丛层厚度/视网膜总厚度增加（ P<0.05），毛细血管无细胞新生毛细血管形成增多和周细胞缺失明显。与对照组和STZ组比较，STZ+SP组视网膜组织ROS水平均升高（ P<0.05）。与对照组比较，STZ+SP组claudin-1和occludin mRNA下降（ P<0.05），相应的蛋白表达亦降低（ P<0.05）。 结论:BN大鼠尾静脉注射STZ联合玻璃体注射SP能建立一种严重的DR动物模型，病变特征主要表现为更严重的视网膜血管顺应性下降，血流供应减少，视网膜水肿，新生无细胞毛细血管大量生成以及视网膜周细胞凋亡增多。

目的:拟通过动物实验阐明脓毒症早期骨髓血管内皮系统在组织、细胞层面以及转录水平发生的变化。方法:通过盲肠结扎穿刺(cecal ligation and puncture，CLP)建立小鼠脓毒症模型，利用HE染色、组织免疫荧光、流式细胞分析以及实时荧光定量PCR等技术分析骨髓血管结构、通透性、血管内皮细胞相对比例和血管内皮细胞活化基因mRNA表达情况。结果:骨髓血管系统在脓毒症早期发生一系列适应性改变。组织学分析表明，骨髓血管结构发生明显重塑，CLP组小鼠骨髓血窦平均密度为(410.43±72.63)个/mm 2，较假手术组(294.43±68.94)个/mm 2明显增加( P<0.01)；管腔面积占比为(43.46±3.21)%，显著高于假手术组[(30.28±4.44)%， P<0.001]；CLP组小鼠骨髓组织中伊文思蓝含量为(0.42±0.12)ng/mg组织，显著高于假手术组[(0.24±0.09)ng/mg组织， P<0.05]，提示血管通透性升高。流式细胞分析结果表明，CLP组小鼠骨髓内皮细胞呈现增殖状态，Ki67 ＋内皮细胞比例升高[(1.91±0.65)%比(5.06±1.10)%， P<0.01]；转录水平分析表明，与血管内皮细胞活化有关的部分基因mRNA水平上调。 结论:早期脓毒症改变了骨髓血管和血管内皮细胞的结构与功能，对骨髓微环境产生了较为显著的影响。

目的:探讨高危型人乳头状瘤病毒（HPV）E6/E7 mRNA原位杂交技术在宫颈上皮内瘤变（CIN）分级诊断中的应用价值。方法:收集四川大学华西第二医院2019年7月至2020年6月组织病理诊断为CIN与宫颈鳞状细胞癌的病例共261例，其中CIN1级60例、CIN2级41例、CIN3级51例、鳞癌72例和形态学正常的宫颈对照组织37例（HPV阴性10例、阳性27例）。将所有病理组织制成组织芯片，分别进行HE染色、HPV E6/E7 mRNA原位杂交检测及p16免疫组织化学染色，在光镜下完成染色判读，并统计分析其阳性率及阳性模式。结果:HPV mRNA原位杂交在CIN1级中主要表现为鳞状上皮基底至中层细胞核与质的点状染色（≤BME）及伴表层细胞内弥散整个核的片状染色（supD），即≤BME+supD模式；在CIN2级中主要表现为基底直至中层之上但未达上皮全层的细胞核与质的点状染色模式（>BME）和部分伴supD染色的模式，即>BME+SupD模式；CIN3级主要表现为>BME模式，且点状染色分布于上皮全层。在CIN1级、2级和3级中，上述3种染色模式差异有统计学意义（ P<0.05）。 结论:HPV mRNA原位杂交技术有助于CIN的准确诊断与分级，且有着比p16免疫组织化学染色更佳的特异性。

目的:探讨肺炎克雷伯菌(KP)外膜蛋白A(OmpA)和黏附素MrkD优势抗原表位融合蛋白对KP感染小鼠的免疫保护作用。方法:根据(美国)国家生物技术信息中心(NCBI)公布的KP ompA和mrkD序列，通过生信分析选取这两个蛋白的优势抗原表位，经融合聚合酶链反应(PCR)扩增表位序列后克隆至pColdI载体，并转入本科室保存的大肠杆菌BL21(DE3)，经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，Ni ＋层析凝胶纯化后获得重组蛋白rAD。rAD经皮下免疫22只BALB/c小鼠，同时设置22只佐剂对照组。完成免疫程序后通过酶联免疫吸附试验(ELISA)对小鼠血清中的抗体水平和脾脏体外抗原刺激后细胞因子分泌水平进行测定，并对小鼠鼻腔注射KP，观察免疫后的小鼠存活率和肺脏细菌数量。组间比较采用 t检验。 结果:分别扩增出ompA和mrkD抗原表位序列，并成功融合，融合片段大小为1 056 bp，与预测大小一致，克隆至pColdI载体后测序，测序正确。重组表达菌BL21(DE3)-pColdI-rAD经IPTG诱导后破碎收集上清纯化，获得可溶性rAD，大小为38.4×10 3，与预测大小一致。rAD 3次免疫BALB/c小鼠后，免疫组抗体滴度显著高于对照组(170 667.00±59 121.00比0.00±0.00， t＝5.00， P<0.01)。KP感染小鼠后，免疫组小鼠存活率显著高于对照组[(65.00±5.00)%比(0.00±0.00)%， t＝22.52， P<0.01]，免疫组小鼠肺脏细菌数显著低于对照组[(9 500.00±1 384.00) CFU比(87 833.00±25 365.00) CFU， t＝7.55， P<0.01]。脾细胞分离后经rAD刺激，免疫组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-4(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)分泌量均显著高于对照组[(115.70±17.21) pg/ml比(24.00±9.17) pg/ml， t＝8.14， P<0.01；(200.30±8.51) pg/ml比(9.00±3.00) pg/ml， t＝36.75， P<0.01；(92.33±6.11) pg/ml比(9.67±1.53) pg/ml， t＝22.73， P<0.01]。 结论:KP OmpA和MrkD优势抗原表位融合蛋白rAD，免疫BALB/c小鼠有助于对KP感染的抵抗。

目的:通过基因表达谱研究儿童ETV6-RUNX1阳性急性淋巴细胞白血病（ALL）异质性，探索不同聚类分组临床特征，为临床个性化诊疗及利用测序技术探索预后相对不良组预测模型提供可行性参考。方法:应用改进的基因片段分析技术对2016年8月至2019年6月北京儿童医院收治的264例初诊ALL患儿的骨髓标本进行57个分型基因检测和聚类分析，重点分析56例ETV6-RUNX1阳性患者的基因表达谱与临床特点、免疫表型和早期化疗反应的关系。结果:基因分型聚类显示ETV6-RUNX1阳性ALL被分为两组：E/R-1组（45例，80.4%）和E/R-2组（11例，19.6%）。E/R-2聚类离散度大于E/R-1，spearman相关系数分别为0.788、0.901；E/R-2、E/R-1组初诊PLT中位数分别为104（27~644）×10 9/L、50（8~390）×10 9/L（ P<0.01），初诊骨髓原始幼稚细胞比例分别为0.830（0.270~0.975）、0.935（0.445~0.990）（ P<0.05）；CD22 +CD34 +CD20 -CD117 -CD56 -免疫组合在E/R-2组占比更高（ P<0.001）；E/R-2和E/R-1组化疗第33天流式细胞术检测的微小残留病（MRD）转阴例数分别为5例（55.6%）和32例（88.9%）（ P=0.064），去除临界值病例敏感性分析转阴例数分别为5例（55.6%）和32例（91.4%）（ P=0.035）；第33天PCR检测的MRD转阴例数分别为7例（77.8%）和36例（100.0%）（ P=0.047）。 结论:ETV6-RUNX1阳性ALL患儿在基因表达谱层面存在异质性，符合E/R-2表达特征的患儿可能初诊时血小板减少倾向小但早期化疗反应相对不良。

目的:探索制备新型负压材料以构建大鼠全层皮肤缺损创面新生基质的可行性。方法:采用实验研究方法。取负压治疗中常用的聚氨酯泡沫敷料，于扫描电子显微镜下观察其微观结构并测定其孔径（样本数为5）。分别以聚己内酯、聚丁二酸丁二醇酯（PBS）为原材料，采用熔体纺丝技术，以测得的聚氨酯泡沫敷料孔径为纺丝间距，分别以15、25、35 mm/s为纺丝速率制备聚己内酯负压材料和PBS负压材料，于扫描电子显微镜下观察制备的负压材料微观结构并测定其丝径，采用拉力试验机与复合材料试验机分别测定制备的负压材料和聚氨酯泡沫敷料的拉伸强度与拉伸模量（样本数均为5），以筛选后续制备负压材料的纺丝速率。将对数生长期的人皮肤成纤维细胞（Fb）分别与以筛选的纺丝速率制备的聚己内酯负压材料和PBS负压材料共培养，于共培养1、4、7 d，用活/死细胞检测试剂盒检测材料中细胞活性与黏附情况，用细胞计数试剂盒8法检测材料中细胞增殖水平（样本数为5）。于18只5~6周龄雌雄不限的SD大鼠背部各制备1个全层皮肤缺损创面，伤后即刻，将致伤大鼠按随机数字表法分为聚己内酯+聚氨酯组、PBS+聚氨酯组、单纯聚氨酯组（每组6只），用含相应成分材料覆盖创面，以-16.7 kPa负压进行持续负压吸引。分别于负压治疗7、14 d取每组3只大鼠，取创面组织与创面直接接触层材料（以下简称创面取材），行苏木精-伊红染色后观察肉芽组织生长及材料与创面结合情况，行Masson染色后观察胶原纤维沉积情况，采用免疫组织化学法检测并计数CD34、白细胞介素6（IL-6）阳性细胞。对数据行单因素方差分析、析因设计方差分析、LSD- t检验、Kruskal-Wallis H检验、Mann-Whitney U检验及Bonferroni校正。 结果:聚氨酯泡沫敷料微观上呈疏松多孔结构，孔径为（815±182）μm。以800 μm为后续负压材料制备中的纺丝间距。PBS负压材料与聚己内酯负压材料的微观结构均较为规则，层间垂直相通，纺丝连续且粗细均匀，但PBS负压材料纺丝较聚己内酯负压材料平直；不同纺丝速率下由同种原材料制备的负压材料微观结构无明显差别。以3种纺丝速率制备的聚己内酯负压材料的丝径相近（ P>0.05），以25、35 mm/s的纺丝速率制备的PBS负压材料的丝径均明显小于以15 mm/s的纺丝速率制备的PBS负压材料（ t值分别为4.99、6.40， P<0.01）。以3种纺丝速率制备的聚己内酯负压材料的拉伸强度、拉伸模量均相近（ P>0.05）；以15、25 mm/s的纺丝速率制备的PBS负压材料的拉伸强度均明显小于以35 mm/s的纺丝速率制备的PBS负压材料（ t值分别为9.20、8.92， P<0.01），拉伸模量均明显小于以35 mm/s纺丝速率制备的PBS负压材料（ t值分别为2.58、2.47， P<0.05）。后续选用35 mm/s的纺丝速率制备聚己内酯负压材料，选用15 mm/s的纺丝速率制备PBS负压材料。共培养1、4、7 d，在聚己内酯负压材料和PBS负压材料中黏附生长的人皮肤Fb数随时间延长而增多，2种材料间比较无明显差别。共培养1、7 d，2种负压材料中人皮肤Fb增殖水平均相近（ P>0.05）；共培养4 d，PBS负压材料中人皮肤Fb增殖水平显著高于聚己内酯负压材料（ t=6.37， P<0.01）。负压治疗7 d，3组大鼠创面取材中材料均清晰可辨且均可见少量胶原纤维，单纯聚氨酯组大鼠创面取材中可见少量肉芽组织；负压治疗14 d，3组大鼠创面取材中均可见大量肉芽组织与大量胶原纤维，聚己内酯+聚氨酯组大鼠创面取材中材料与创面组织分辨不清。负压治疗7、14 d，单纯聚氨酯组大鼠创面取材中胶原纤维均较另外2组致密。负压治疗7 d，每400倍视野下，PBS+聚氨酯组大鼠创面取材中CD34阳性细胞数为（14.8±3.6）个，明显少于单纯聚氨酯组的（27.8±9.1）个（ t=3.06， P<0.05）；IL-6阳性细胞数为60（49，72）个，明显多于单纯聚氨酯组的44（38，50）个（ Z=2.41， P<0.05）。负压治疗14 d，每400倍视野下，PBS+聚氨酯组大鼠创面取材中IL-6阳性细胞数为19（12，28）个，明显多于聚己内酯+聚氨酯组的3（1，10）个与单纯聚氨酯组的9（2，13）个（ Z值分别为2.61、2.40， P<0.05）。 结论:制备的聚己内酯负压材料和PBS负压材料生物相容性好，均可成功构建大鼠全层皮肤缺损创面新生基质，其中聚己内酯负压材料总体上优于PBS负压材料。

目的：:观察分析飞秒激光辅助大泡技术深板层角膜移植治疗角膜基质层营养不良的疗效及安全性。方法：:回顾性系列病例研究。选择2015年1月至2017年9月于山东省眼科医院接受飞秒激光辅助大泡技术深板层角膜移植治疗的角膜基质层营养不良患者16例（19眼），术后随访1年以上且随访资料完整。其中包括颗粒状角膜营养不良6眼，斑块状角膜营养不良8眼，格子状角膜营养不良5眼。随访12～32（17.1±1.3）个月，观察患者术前及随访时裸眼视力（UCVA）、最佳矫正视力（BCVA）、眼压、角膜散光度、等效球镜度（SE）、平均角膜曲率、角膜内皮细胞密度、植片排斥反应、术后并发症及复发情况等。结果：:所有患者手术均顺利完成。术前BCVA为光感～0.25，其中小于0.10者10眼，0.10～0.25者9眼；末次随诊时为0.12～0.80，其中0.10～0.25者5眼，0.30～0.40者5眼，≥0.50者9眼。视力（标准对数视力表）提高2.00～8.00（5.3±1.8）行。术前角膜散光0.50～2.60（1.62±0.57）D，末次随诊时1.30～4.20（2.56±0.87）D；术前SE -4.00～+1.25（-1.29±1.86）D，末次随诊时-7.50～+8.00（-0.48±3.84）D；术前角膜曲率42.78～45.38（44.24±0.95）D，末次随诊时39.20～45.06（43.12±2.22）D；术后12个月时的角膜内皮细胞较术后1个月时的角膜内皮细胞丢失率为8%。末次随诊时测量植床厚度为20～39（29.4±6.1）μm。术后并发症为1眼术中植床微小穿孔，1眼术后首日可见植片、植床层间少量积血，处理后病情稳定。所有患者末次随诊时均可见角膜植片与植床紧密贴合且透明，未见松线、层间积液及植片免疫排斥反应，未见营养不良病变复发。结论：:飞秒激光辅助大泡技术深板层角膜移植是治疗角膜基质层营养不良的安全方法，术后散光较少，视力较好。

单细胞测序技术是新近生物学领域一项前沿技术，能够揭示单个细胞的基因序列和表达修饰，反映细胞间的异质性，正成为生命科学领域的焦点研究方法。免疫系统的单细胞测序研究作为细胞形态学和功能学等传统方法的补充，通过分析免疫细胞的基因表达状态，获取其中的可变剪切和特异转录本，从而发现新的细胞类型，揭示免疫细胞发育谱系，鉴定决定免疫反应的基因模块和调控程序，从单细胞生物学水平更深层次阐明自身免疫病的发病机制，从而探寻新的治疗策略。本文对单细胞测序在自身免疫病研究中的最新进展予以综述。