目的:研究内向整流钾通道(IK1)激动剂扎考必利(zacopride,Zac)对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导的心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFb)细胞活力和凋亡的影响,探讨其抑制心肌纤维化的机制.方法:以组织块消化和差速贴壁法原代分离培养SD乳鼠心室成纤维细胞,用AngⅡ诱导细胞建立细胞活化模型.将分离培养的CFb随机分为空白对照组、AngⅡ模型组、Zac干预组、Zac+BaCl2干预组、Zac+氯喹干预组和AngⅡ+卡托普利阳性对照组.CCK-8法检测Zac对CFb活力的影响;ELISA法测定CFb上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot检测心肌内向整流钾通道蛋白Kir2.1表达的变化.结果:与空白对照组比较,AngⅡ模型组CFb活力及胶原合成显著增加,Kir2.1的表达降低(P<0.05);与AngⅡ模型组比较,Zac干预组CFb活力及胶原合成显著降低,凋亡率显著升高,Kir2.1的表达明显上调(P<0.05);IK1阻断剂BaCl2和氯喹可阻断Zac对IK1通道的激动效应,明显逆转Zac的抗心肌纤维化作用.结论:Zac可明显抑制AngⅡ诱发的心肌纤维化,其机制可能与激动心肌内向整流钾通道,进而抑制成纤维细胞活力并诱导其凋亡有关.

目的:分析内向整流钾通道2.1 蛋白(Kir 2.1) 在小鼠伏隔核区中等多棘神经元的表达分布模式.方法:成年Drd1-tdTomato/Drd2-eGFP双转基因小鼠,制备含伏隔核区冠状脑片,运用免疫组织化学方法对Kir 2.1进行染色.通过激光共聚焦显微镜成像及应用Imaris等软件对表达Drd1的多巴胺受体1型(D1) 中等多棘神经元(D1-MSNs)和表达Drd2的多巴胺受体2型(D2)中等多棘神经元(D2-MSNs)胞体上Kir 2.1免疫荧光阳性信号的密度进行分析.结果: Kir 2.1阳性信号颗粒在伏隔核区域的分布密度大概为0.3 个/μm2 .D1-MSNs胞体上Kir 2.1荧光像素值与D2-MSNs相比无显著差异.结论:Kir 2.1在伏隔核区多巴胺能神经元介导的直接通路及间接通路上的表达含量相似.

目的:研究扎考比利 (zacopride, ZAC) 对腹主动脉缩窄所致大鼠压力超负荷性心室重构的改善作用.方法:通过腹主动脉缩窄构建大鼠压力超负荷心室重构模型, 预防性给予ZAC、氯喹 (chloroquine, Chlor) 及ZAC+Chlor.连续给药8周, 超声心动图评价心功能;计算心重/体重比 (HW/BW) 和左心室/体重比 (LVW/BW) ;左心室心肌组织HE染色;透射电镜观察心肌细胞超微结构;Western blot检测大鼠心肌组织内向整流钾通道 (IK1) 蛋白表达;RT-PCR法检测心肌组织Kir2.1的mRNA表达.结果:与模型 (vehicle) 组相比, ZAC组大鼠心功能明显改善, LVEDS和LVEDD明显降低 (P <0.05) , LVEF和LVFS显著升高 (P <0.01) , HW/BW和LVW/BW显著降低 (P <0.05) , 心肌肥大程度降低, 心肌细胞横断面积明显减小 (P <0.01) , 心肌超微结构明显改善.Chlor明显阻断了ZAC对腹主动脉缩窄所致压力超负荷大鼠心室重构的保护作用.与vehicle组相比, ZAC组大鼠心肌组织IK1蛋白表达和Kir2.1的mRNA显著升高 (P <0.01) .结论:心肌IK1激动剂ZAC显著减轻大鼠左心室压力超负荷诱发的心室重构.

目的 通过耐力运动训练兔动物模型探索运动相关性心房颤动(AF)的发生机制.方法 36只新西兰大耳兔随机分为对照组、中强度耐力训练组、高强度耐力训练组(每组12只):对照组不做任何耐力训练处理;耐力运动训练组每周训练5d,每天1h或一次性力竭(不足1 h),共持续16周(中强度耐力训练组:坡度0度,速度15 m/min;高强度耐力训练组:坡度0度,速度30 m/min).训练完成后,各组随机各取6只,共18只兔采用离体心脏Langendorff系统进行灌流,将1 μmol/L乙酰胆碱(Ach)+不同浓度的氯化钡(BaC12)溶液(0、0.1、0.5、1、3、6μmol/L)灌入冠脉内,开始持续给药过程中电生理指标的测定及记录.在左心耳置入的电极分别记录相应的心房有效不应期(AERP)及90％动作电位时程(APD90)、并给予心脏期前程序刺激(S1S2)诱发房颤,记录并计算房颤发生率.灌流完后剪取兔左心房,经实时荧光定量(qRT)-PCR技术检测心房肌组织内向整流钾电流/通道(IK1) kir2.1、kir2.2、胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白Ⅲ的mRNA表达量.取各组剩余6只实验兔,共18只取左心房组织标本,应用Masson染色进行组织学检查,测定心肌组织胶原容积分数.结果 长期高强度的运动训练16周后,不同组间,Ach背景相同,BaC12剂量相同作用下,随着运动强度的增加,APD90、AERP相应缩短,房颤发生率增加,BaC12取0～6 μmol/L时,高强度耐力训练组与其余两组间比较差异均有统计学意义(P＜0.001),而其余两组之间差异无统计学意义.同一组内,Ach背景相同,随着BaC12剂量的增加,APD90、AERP相应延长,房颤发生率降低,3组组内比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).随着运动量的增加,兔左心房kir2.1、kir2.2、胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白Ⅲ的mRNA表达量均增加,胶原容积分数增加,高强度耐力训练组＞中强度耐力训练组＞对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 长期的高强度耐力运动训练可通过增加实验兔心房组织纤维化程度、心肌细胞IK,数量和(或)功能,改变心电传导,促使实验兔房颤发生和维持.

目的 探讨橙皮素(HSP)对离体大鼠肾内动脉(RIA)肌原性反应的影响,并分析其与蛋白激酶C(PKC)、内向整流钾通道(Kir)的相关性.方法 将雄性SD大鼠断头处死后,取其肾脏放于生理盐溶液(PSS)中,显微镜下分离并剪取2 mm的RIA血管环用于微血管张力测定实验.血管环抑制收缩实验:将同一根RIA的不同段随机分为KCl收缩组、PE收缩组、VP收缩组、BaCl2收缩组(加入30μmol·L-1 HSP预孵30 min后分别加入60 mmol·L-1 KCl,10μmol·L-1 PE,3μmol·L-1 VP,0.3 mmol·L-1 BaCl24种收缩剂直至RIA达到收缩坪台);舒张机制实验:将同一根RIA的不同段随机分为KCl预收缩组、PE预收缩组、VP预收缩组、BaCl2预收缩组(预收缩组中加入上述相同浓度的4种收缩剂收缩RIA后,加入PKA、PKC抑制剂各1μmol·L-1预孵15 min,30μmol·L-1 HSP舒张RIA).膜片钳实验:将RIA平滑肌细胞(SMCs)Kir电流密度分为BaCl2联合组、G?6983联合组;实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR):将RIA分为对照组和HSP组(预孵30μmol·L-1 HSP 8h).用血管环实验记录RIA血管张力的变化,用膜片钳实验记录RIA SMCs Kir电流密度的变化,用qRT-PCR检测Kir2.1和PKC-α、PKC-β基因表达水平.结果 KCl收缩组,PE收缩组,VP收缩组,BaCl2收缩组RIA收缩百分率分别为(24.25±6.11)％,(20.09±12.67)％,(48.14±1.68)％,(15.26±6.66)％;KCl预收缩组,PE预收缩组,VP预收缩组,BaCl2预收缩组的舒张百分率分别为(21.35±5.55)％,(27.84±8.64)％,(23.30±12.01)％,(19.22±2.22)％;BaCl2联合组、G?6983联合组RIA SMCs Kir电流分别为(-4.29±0.26),(-10.65±1.10)pA/pF;Kir 2.1通道、PKC-α、PKC-β的mRNA相对表达量分别为1.91±0.23,0.52±0.29,0.69±0.14.组间比较,差异均有统计学差异(均P<0.05).结论 HSP有抑制RIA收缩的作用,且HSP该作用与舒张预收缩RIA的作用均可能与Kir通道的开放和PKC介导的通路有关.

目的:探讨心肌内向整流钾通道IRK1激动剂扎考必利(Zac)后适应减轻心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤的作用及机制.方法:胶原酶法分离成年雄性SD大鼠心室肌细胞,体外利用矿物油覆盖法建立H/R损伤模型.细胞分别缺氧45和75 min之后去除上层石蜡油密封层并更换新鲜台氏液,复氧30 min;2种损伤模型复氧前分别给予0.1、1和10μmol/L的Zac进行药物后适应;激光共聚焦显微镜观察比较Fluo-4负载细胞内游离钙离子浓度;Western blot法测定各组心肌细胞IRK1主要亚单位Kir2.1蛋白的表达.此外,在心肌H9c2(2-1)细胞建立H/R模型,分别缺氧3和5 h,之后复氧2 h;2种损伤模型复氧前分别加入0.1、1和10μmol/L Zac进行药物后适应;ELISA法检测乳酸脱氢酶和caspase-3含量;CCK-8法检测细胞活力;Western blot法测定各组心肌细胞PI3K/Akt信号通路相关蛋白的水平.结果:成年大鼠心室肌细胞复氧时预先给予0.1～10μmol/L Zac可有效抑制H/R引起的IRK1抑制和细胞内钙超载.在心肌H9c2(2-1)细胞H/R模型中,0.1～10μmol/L Zac后适应可激活PI3K/Akt信号通路,减少心肌细胞的坏死和凋亡,其中0.1μmol/L Zac为最适效应浓度;IRK1阻断剂BaCl2可有效抑制Zac的效应(P<0.01),表明Zac的后适应保护是IRK1依赖的.结论:通过激动心肌IRK1减轻心肌细胞内钙超载并激活PI3K/Akt信号通路是减轻H/R损伤的有效策略.IRK1可能成为拮抗心肌缺血/再灌注损伤药物作用的新靶点.

目的:通过激活或阻断内向整流钾通道2.1(inwardly-rectifying potassium channel 2.1,Kir2.1),检测巨噬细胞M1/M2型极化标志物及相关细胞因子的改变,探讨Kir2.1在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)或白细胞介素4(interleukin-4,IL-4)诱导的巨噬细胞M1/M2型极化过程中的具体作用.方法:采用RAW264.7小鼠巨噬细胞系,将未转染慢病毒的RAW264.7细胞分为对照(control)组、LPS组、IL-4组、LPS+zacopride(Kir2.1选择性激动剂)组及IL-4+ML133(Kir2.1选择性阻断剂)组,将转染慢病毒的RAW264.7细胞分为vector组、LPS+vector组、IL-4+vector组、KD-shKir2.1组、LPS+KD-shKir2.1组及IL-4+KD-shKir2.1组.应用ELISA技术检测巨噬细胞培养液上清中IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的浓度;应用实时荧光定量PCR技术检测巨噬细胞中Kir2.1、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、CD86、CD206、IL-6及TNF-α的mRNA表达;应用细胞免疫荧光技术和Western blot技术检测巨噬细胞中Kir2.1、iNOS、CD86及CD206的定位和表达.结果:Kir2.1在RAW264.7细胞的胞膜及胞质中均有表达,并且LPS干预RAW264.7细胞后Kir2.1的蛋白表达显著下降(P<0.01),IL-4干预巨噬细胞后Kir2.1的蛋白表达显著升高(P<0.01).激活Kir2.1能够显著减少炎症细胞因子的释放(P<0.05或P<0.01),降低M1型极化标志物iNOS和CD86的mRNA和蛋白表达(P<0.05或P<0.01),而阻断或敲减Kir2.1能够显著增加炎症细胞因子的释放(P<0.05或P<0.01),升高M1型极化标志物iNOS和CD86的mRNA和蛋白表达(P<0.05或P<0.01),降低M2型极化标志物CD206的mRNA和蛋白表达(P<0.05或P<0.01).结论:激活Kir2.1能够抑制LPS诱导的巨噬细胞向M1型极化;而阻断或敲减Kir2.1能够促进LPS诱导的巨噬细胞向M1型极化,抑制IL-4诱导的巨噬细胞向M2型极化.

目的 探讨血管紧张素Ⅱ受体1型(AT1R)—半胱氨酸丰富跨膜成骨蛋白调控因子(Crim1)信号通路在乳鼠肥大心室肌细胞编码内向整流钾电流离子通道的Kir2.1 mRNA和蛋白表达调控中的作用.方法 分离1 d龄SD大鼠乳鼠心室获心室肌细胞,给予腺病毒空载体(Ad-Null)、Crim1基因重组腺病毒载体(Ad-Crim1)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和/或氯沙坦(Los)分组干预.实时荧光定量逆转录PCR检测肌球蛋白重链β(β-MHC)、Kir2.1和Crim1的mRNA表达.Western免疫印迹法检测全细胞提取蛋白Kir2.1和Crim1的表达,细胞结晶紫染色测量表面积.结果 AngⅡ干预24 h明显增加心室肌细胞β-MHC的mRNA表达及细胞面积;下调Crim1和Kir2.1的mRNA和蛋白表达.Ad-Crim1和Los干预明显抑制Ang Ⅱ干预的上述效应;Ad-Crim1联合Los较Ad-Crim1单独应用能更显著抑制AngⅡ刺激的上述效应.结论 AT1R-Crim1信号通路参与乳鼠肥大心室肌细胞Kir2.1 mR-NA和蛋白表达的调控.

目的 探讨内向整流钾(Kir)2.1通道蛋白对人牙囊细胞(hDFC)成骨分化的影响及其机制.方法 组织块结合酶消化法分离、培养hDFC,流式细胞术鉴定细胞来源,成骨诱导鉴定hDFC成骨分化能力;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Kir2.1编码基因KCNJ2在hDFC中的表达,定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测Kir2.1在hDFC成骨诱导前和诱导后KCNJ2基因表达量的变化;膜片钳技术检测hDFC在成骨诱导前和诱导后的细胞膜电位变化;提高细胞外钾离子的浓度(50 mmol·L-1)观察膜电位去极化对hDFC成骨分化能力的影响,应用Kir2.1钾通道阻断剂氯化铯(CsCl)和4-甲氧基苄基-1-萘基甲基-胺盐(ML133)观察阻断Kir2.1通道对hDFC成骨分化能力的影响,同时行RT-qPCR检测观察2种干预措施前后成骨分化相关基因[RUNX相关转录因子2(RUNX2)、骨钙素(OCN)]的表达变化情况.降低细胞外钾离子的浓度(2 mmol·L-1),钙离子成像检测膜电位超极化对细胞内钙离子浓度的变化.结果 RT-PCR结果显示,hDFC表达Kir2.1通道基因KCNJ2;RT-qP-CR结果显示,成骨诱导7 d后,KCNJ2在hDFC中的表达量上调;膜片钳结果显示,成骨诱导7 d后,hDFC膜电位由(-12±3.2)mV超极化为(-47±5.2)mV;茜素红和碱性磷酸酶染色结果显示,提高细胞外钾离子的浓度或阻断Kir2.1通道蛋白的功能,能够明显抑制hDFC的成骨矿化能力;钙离子成像结果显示,膜电位超极化能够引起细胞内钙离子浓度的增高.结论 Kir2.1通道蛋白介导的膜电位超极化在hD-FC成骨分化的过程中起重要的作用.