目的 建立耐唑类抗真菌药的白念珠菌(C.albicans)标准菌株,参照《病原微生物菌(毒)种国家标准株评价技术标准》(WS/T 812-2022)要求做好病原微生物菌(毒)种保藏工作,为其他真菌标准菌株的候选提供参考方法.方法 通过菌株表型、鉴定、测试9种抗真菌药物敏感性和耐药基因,评估菌株保存状态下的表型稳定性和活性.结果 菌株经内部转录间隔区(ITS)序列分析和质谱仪(MALDI-TOF MS)鉴定为白念珠菌,连续传代十次仍有稳定的分子生物学特征.该菌株对氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑的最低抑菌浓度(MIC)分别为16 mg/L、0.5 mg/L、0.5 mg/L和0.5 mg/L,耐药性与ERG11基因双点突变(A114S、Y257H)及编码药物外排泵基因突变(A736V)相关.菌株在-80 ℃表型稳定至少6个月.结论 本研究建立了耐唑类抗真菌药白念珠菌标准菌株,为白念珠菌感染性疾病的综合防治提供了重要的研究对象和物质基础,对于国家生物安全具有重要的战略意义.

目的 报道安徽铜陵地区首例血流感染耳念珠菌一例,并对该菌株的耐药性和来源情况进行分析.方法 采用质谱和基因测序技术,对安徽省某三级医院重症监护室(ICU)一名血液感染患者的耳念珠菌株进行鉴定并分析其对多种药物的耐药性、菌种来源和毒力.结果 药敏试验提示本例耳念珠菌对唑类及多烯类抗真菌药物均耐药,对5-氟胞嘧啶敏感.全基因组测序检出ERG11基因和CDR1基因发生了突变,前者132号位由酪氨酸突变为苯丙氨酸,后者709号氨基酸由谷氨酸突变为天冬氨酸.麦角甾醇通路相关基因ERG1、ERG2、ERG6、ERG13未检测出突变.通过比较内部转录间隔区(ITS)序列得出的系统发生树显示,与我们分离的菌株关系最密切的菌株是印度菌株.结论 本例耳念珠菌造成的血流感染为安徽省内首次报道,质谱和基因测序能够准确鉴定耳念珠菌.此外,全基因组测序能够深入分析耳念珠菌的高度耐药性、菌种来源和高毒力性.

目的 明确宁夏银川地区奶牛毕氏肠微孢子虫的感染情况及其主要基因型.方法 2021年8月—2022年8月,在银川市及周边县6个规模化奶牛场采集奶牛新鲜粪样(包括腹泻粪样和非腹泻粪样),提取粪样基因组DNA,用毕氏肠微孢子虫内部转录间隔区(ITS)引物进行巢式PCR,回收PCR产物后送测序并进行BLAST比对,鉴定毕氏肠微孢子虫基因型.采用SPSS 25.0软件进行分析,不同月龄奶牛毕氏肠微孢子虫阳性率差异的比较采用x2检验.结果 共采集奶牛粪样772份,巢式PCR扩增结果显示,奶牛毕氏肠微孢子虫阳性率为8.7％(67/772),目的条带大小约为400 bp.不同牧场的奶牛毕氏肠微孢子虫阳性率为4.8％(6/124)～11.5％(18/156),差异有统计学意义(x2=30.828,P＜0.05).5～7月龄犊牛的阳性率最高(15.6％,23/147),12月龄以上育成牛的最低(3.4％,5/149),不同月龄的奶牛阳性率差异有统计学意义(x2=59.529,P＜0.05).腹泻粪样中毕氏肠微孢子虫的阳性率为10.6％(42/398),高于非腹泻粪样(6.7％,25/374)(x2=3.419,P＜0.05).测序共检出66条毕氏肠微孢子虫序列,分为CHN4、BEB4、J、I型等4种基因型,提交GenBank获得的登录号分别为OR352930、OR352929、OR352932 和 OR352931.其中 CHN4 型 3 条(占 4.5％),与 G1 亚群 CHN4 基因型(HM992511)的序列一致性为98.4％;BEB4型18条(占27.3％),与G2亚群BEB4基因型(AY331008)的序列一致性为96.3％;J型22条(占33.3％),与G2亚群J基因型(AF135837)的序列一致性为93.1％;I型23条(占34.9％),与G2亚群I基因型(AF135836)的序列一致性为91.1％.不同月龄奶牛感染的毕氏肠微孢子虫的优势基因型不同,BEB4型、J型和I型毕氏肠微孢子虫在奶牛的各个月龄段均存在,3种基因型的总和分别占阳性腹泻粪样和阳性非腹泻粪样的88.1％(37/42)和60.0％(15/25),二者差异有统计学意义(x2=3.419,P＜0.05).结论 宁夏银川地区奶牛存在毕氏肠微孢子虫感染,主要基因型为BEB4、J和I基因型.

目的 对维药克孜力乔古鲁克药材(Paeoniae radix hybridae,PRH)的品种进行精准鉴别,同时将其原植物块根芍药Paeonia hybrida Pal1.与窄叶芍药P.anomalaL.和新疆芍药P.sinjiangensisK.Y.Pan进行区分,为保证药材来源的准确性提供科学依据.方法 提取块根芍药的DNA,基于内部转录间隔区的核糖体DNA序列(ITS)进行PCR引物扩增并测序,并从GenBank数据库下载块根芍药和其原变种窄叶芍药和近缘种新疆芍药的ITS序列,采用DNAMAN、Editseq、MeGA5等软件,计算块根芍药种间、种内的Kimura 2-parameter(K 2-P)遗传距离,寻找块根芍药的特异位点,并构建Neighbor-joining (N-J)系统聚类树.结果 块根芍药G+C含量范围为55.82％～56.45％,与另外两个种G+C含量未重叠;所有样本ITS序列的K 2-P遗传距离范围为0～0.026,其中种间遗传距离分布为0.014 ～0.026,大于块根芍药种内遗传距离0.000 ～0.012;通过序列比对分析,发现块根芍药与另外2个种有6个特异位点;N-J系统聚类树也将19个样品聚为两个大支系,所有块根芍药聚为一支,有84％支持率,其中中国地区分布的块根芍药聚为一小支,俄罗斯地区分布的块根芍药亲缘关系较远.结论 经过遗传距离、系统聚类、特异位点分析等系统研究发现ITS序列能区分块根芍药与其原变种窄叶芍药和近缘种新疆芍药,可以应用于维药PRH的精准鉴别,并且在变种与原变种的区分方面有很大潜力.

目的:基于DNA条形码技术建立肉苁蓉样品的高分辨率熔解曲线(HRM)鉴定方法.方法:通过聚合酶链式反应(PCR)对肉苁蓉的ITS和ITS2序列进行扩增;利用MEGA 6.06软件通过建树法进行NJ树聚类分析;通过ITS2序列利用Primer Premier 5软件进行引物设计;对经设计、合成的8对引物通过HRM实验进行筛选;建立肉苁蓉的HRM鉴定方法.结果:通过ITS和ITS2序列的NJ树聚类分析可以有效区分3种肉苁蓉(肉苁蓉、管花肉苁蓉及采自乌兹别克斯坦的肉苁蓉相近种),且肉苁蓉和管花肉苁蓉各自的栽培品与野生品不存在明显差异;经过Primer Premier 5软件进行引物设计共选出8对引物进行合成;通过HRM预实验筛选出引物Ysr-2为最佳实验引物;确立了有效鉴定3种肉苁蓉样品的HRM方法.结论:通过DNA条形码和HRM技术均能有效鉴定3种肉苁蓉样品,且结果一致,起到互相验证的作用,为肉苁蓉及其他中药民族药品种的快速鉴定提供了可以参考的依据.

目的:基于DNA条形码技术鉴定重楼栽培品的基原,并比较同物种重楼栽培品与野生品的DNA条形码差异.方法:通过聚合酶链式反应(PCR)对重楼的ITS和ITS2序列进行扩增;通过与GenBank数据库进行Blast比对,确定收集重楼样品的物种;利用距离法和建树法比较重楼样品种内和种间的亲缘关系;比较不同物种样品之间,以及同物种样品的野生品与栽培品之间的碱基差异.结果:收集重楼样品经Blast比对共有10个物种,分别为宽瓣重楼、毛重楼、七叶一枝花、花叶重楼、独龙重楼、五指莲重楼、西藏延龄草、平伐重楼、华重楼、南重楼;除南重楼的ITS序列与毛重楼的平均种间遗传距离小于南重楼的最大种内遗传距离外,各个物种的ITS和ITS2序列的最大种内遗传距离均小于其最小种间平均遗传距离,通过建立NJ树聚类分析,重楼样品的10个物种中相同物种聚类,且具有良好的单系性;从碱基比较结果上看,野生重楼样品与栽培重楼样品的碱基差异很小,甚至完全一致.结论:市场流通重楼药材的性状多样且差异很大并非由于人工驯化造成,而是由于重楼栽培基原的混乱造成的,且多数流通样品为非《中华人民共和国药典》收载物种,通过DNA条形码技术为重楼属药用植物鉴别开辟了一条新途径.

目的:利用核糖体DNA第2内部转录间隔区(ITS2)及其二级结构对传统中药材防己及其混伪品进行分子鉴定及聚类分析.方法:从GenBank上下载36条防己及其混伪品的ITS序列,利用Geneious R11.0.3进行序列比对,运用MEGA 7.0计算种内、种间K2P遗传距离,构建邻接(NJ)系统进化树,同时利用ITS2数据库在线软件预测各样本的二级结构,并利用4Sale软件进行二级结构的比对,最终运用ProfDistS软件基于距离法构建了PNJ进化树.结果:各种间平均遗传距离均远大于种内平均遗传距离,NJ树显示防己及其混伪品聚为6个分支;混伪品与正品的二级结构均有一定的差异;PNJ进化树比NJ树显示出更多的分支和更高的分辨率.结论:虽然ITS2可以作为防己及其混伪品的DNA条形码,但是若包含ITS2二级结构所蕴含的系统发育信息,鉴定结果更加精准.

目的:建立基于中药材DNA条形码技术的知母种子基原鉴定方法,保障知母种子基原的真实性.方法:收集知母的30份基原植物样品和9份生药材样品,获取其参考DNA条形码序列,采用克隆测序方法验证参考序列的准确性.收集51份待检测知母种子样品,获取其DNA条形码序列,基于BLAST法、遗传距离法和邻接(NJ)系统发育树法进行物种鉴定.结果:对于基原植物和生药材样品,由于基因组内存在异质性,核糖体DNA第2内部转录间隔区(ITS2)序列无法稳定获得,但可成功获得psbA-trnH序列.知母序列分为6个单倍型,有3个变异位点,2处插入/缺失,种内变异最大值0.003 5,种间变异最小值0.1,在NJ系统发育树上聚为独立的支.共获得153条知母种子的psbA-trnH序列,经BLAST法、遗传距离法和NJ系统发育树法鉴定均为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides.结论:psbA-trnH是知母种子鉴定的适合条形码序列,可用于知母种子的真实性鉴定.所收集51份知母种子样品的基原均符合2015年版《中国药典》(一部)相关项下规定,未发现伪品.

目的 以核糖体第二核糖体内部转录间隔区 (ITS2) 作为分子标记, 对粉尘螨、屋尘螨、腐食酪螨和热带无爪螨进行系统发育树分析.方法 PCR扩增种常见储藏物螨种的ITS2基因并测序, 进行序列比对分析;从GenBank下载8条螨虫的ITS2序列, 用MEGA 2.1软件构建分子系统树, 进行系统进化分析.结果 分析4种螨的ITS2序列长度为316～487bp, 种内基因遗传距离为0.003 823～0.052 599, 种间遗传距离为0.187 440～0.534 699.以长食酪螨 (Tyrophagus longior) 为外类群构建系统发育树, 进行系统发育分析, 屋尘螨与粉尘螨亲缘关系较近, 腐食酪螨及热带无爪螨分别位于发育树的基部和中部, 系统发育树结果与根据形态分类对应.结论 依据ITS2基因片段序列及系统发育树可对常见螨种鉴定, ITS2基因片段可作为螨种鉴定的分子标记.

目的:运用真核生物核糖体RNA基因(rDNA)内部转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)测序技术对不产孢子菌进行菌属鉴定,揭示海南岛眼部致病性不产孢子菌的生物多样性.方法:选取海南眼科医院检验科分离培养并镜检确定为不产孢子菌的真菌菌株19株,所有菌株均分离自感染性眼病患者眼部感染组织,接种于土豆葡萄糖琼脂培养基和沙氏培养基37℃温箱孵育7～21 d后,镜检未发现生殖结构.采用玻璃研磨器研磨联合化学法提取真菌DNA,PCR扩增核糖体ITS保守序列,通过GenBank基因数据库对扩增出的ITS序列进行比对分析,确定致病菌种属.结果:经PCR扩增后19株样本菌均得到清晰的目的条带.基因测序比对结果显示,19株不产孢子菌分属12个种属,包括可可毛色二孢子菌6株,月状弯孢霉1株,节菱孢霉菌2株,neodeightonia subglabosa 2株,红贝菌1株,肉座菌1株,多喙茎点霉1株,红色毛藓菌1株,深海曲霉菌1株,roussoella siamensis 1株,撕裂蜡孔菌1株、茄病镰刀菌1株.结论:ITS基因测序技术可较准确地鉴定不产孢子菌的种属,是对传统真菌鉴定方法的有益补充.我国海南岛这一热带地区致病性不产孢子菌种属多样,且与多种感染性眼病的发生相关.