目的:分析3个复合杂合变异所致的遗传性凝血因子Ⅶ(FⅦ)缺陷症家系的基因变异类型及其临床特征。方法:选取2021年12月至2022年10月就诊于温州医科大学附属第一医院的3个家系为研究对象。检测3例先证者及其家系成员的凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)和FⅦ活性(FⅦ：C)。用PCR法扩增先证者 F7基因所有的外显子及其侧翼序列，通过直接测序进行变异分析，并用反向测序进行验证，同时分析家系成员相应的变异位点。用ClustalX-2.1-win软件分析变异位点的保守性；用Varcards和Spcards在线软件预测变异位点的致病性；用Pymol软件分析变异前后蛋白质空间结构及分子作用力的变化。 结果:3例先证者的PT均明显延长，APTT在正常范围，FⅦ：C显著下降。基因分析共发现4种 F7基因变异，3例先证者均携带复合杂合变异。先证者1携带p.Cys389Gly和p.His408Gln复合杂合变异；先证者2携带p.Cys389Gly和IVS6＋1G>T复合杂合变异；先证者3携带IVS6＋1G>T和IVS1a＋5G>A复合杂合变异。保守性分析显示p.Cys389和p.His408位点在同源物种间均呈高度保守；Varcards和Spcards软件分析显示上述变异位点均为致病性；蛋白模型分析显示p.Cys389Gly和p.His408Gln变异会分别导致蛋白质空间结构改变和氢键发生变化。 结论:3个FⅦ缺陷症先证者的FⅦ水平降低可能分别与p.Cys389Gly和p.His408Gln复合杂合变异、p.Cys389Gly和IVS6＋1G>T复合杂合变异及IVS6＋1G>T和IVS1a＋5G>A复合杂合变异有关，这3种复合杂合变异的组合既往均未见报道。

目的:对一个遗传性抗凝血酶（AT）与凝血因子Ⅶ（FⅦ）联合缺陷症家系进行临床特征和基因突变分析，探讨 AT基因和 F7基因突变与疾病发生的关系。 方法:家系调查。收集2018年11月来温州医科大学附属第一医院就诊的先证者及其家系成员血液和临床资料（共3代16人），检测凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、纤维蛋白原（FIB）、抗凝血酶活性（AT：A）、抗凝血酶抗原（AT：Ag）、蛋白C活性（PC：A）、蛋白S活性（PS：A）、FⅦ活性（FⅦ：C）及FⅦ抗原（FⅦ：Ag）等指标以明确诊断。提取先证者及其家系成员外周血基因组DNA，用DNA直接测序法分析 AT基因和 F7基因全部外显子、侧翼及5′、3′非编码区，寻找基因异常位点，并通过克隆测序及反向测序进行验证。 结果:先证者（Ⅱ 6）AT：A和AT：Ag明显下降，分别为46%和135 mg/L（参考范围为250~360 mg/L）；其家庭部分成员（父亲Ⅰ 2、小姑Ⅰ 4、堂姐Ⅱ 1、表姐Ⅱ 3、小弟弟Ⅱ 8、侄子Ⅲ 3）AT：A和AT：Ag均降低至正常人的50%左右；其父亲（Ⅰ 2）、小姑（Ⅰ 4）、大弟弟（Ⅱ 7）、小弟弟（Ⅱ 8）、侄子（Ⅲ 3）FⅦ：C分别为45%、50%、48%、47%和48%，而FⅦ：Ag正常。基因分析显示先证者（Ⅱ 6）及其家庭部分成员（父亲Ⅰ 2、小姑Ⅰ 4、堂姐Ⅱ 1、表姐Ⅱ 3、小弟弟Ⅱ 7、侄子Ⅲ 3）AT基因5′非编码区存在rs3138521多态性；其父亲（Ⅰ 2）、小姑（Ⅰ 4）、大弟弟（Ⅱ 7）、小弟弟（Ⅱ 8）、侄子（Ⅲ 3）均存在 F7基因8号外显子c.1091G>A杂合错义突变，导致p.Arg304Gln。 结论:抗凝血酶与凝血因子Ⅶ分别存在rs3138521多态性和c.1091G>A杂合错义突变，可能是导致该家系成员AT与FⅦ联合缺陷的分子机制。

目的:对1个遗传性凝血因子Ⅶ(coagulation factor Ⅶ，FⅦ)缺陷症患者家系进行基因检测与表型分析，寻找致病基因并初步探讨其分子致病机制。方法:PCR扩增先证者 F7基因全部外显子及其侧翼序列和5′端、3′端非翻译区序列，采用直接测序进行基因分析。发现变异位点后用反向测序予以证实，并检测家系成员相应的变异位点。采用ClustalX-2.1-win软件分析氨基酸变异位点的保守性；用PolyPhen-2和Mutation Taster在线生物信息学软件分析变异对蛋白质功能的潜在影响；用Swiss-PdbViewer软件分析氨基酸变异前后蛋白模型及分子间作用力的变化。 结果:基因分析发现先证者 F7基因第8外显子存在c.985T>C(p.Ser329Pro)杂合错义变异及c.1091G>A(p.Arg364Gln)杂合错义变异；其母亲、弟弟和儿子均为c.985T>C(p.Ser329Pro)变异杂合子，父亲为c.1091G>A(p.Arg364Gln)变异杂合子。保守性分析结果表明，p.Ser329和p.Arg364位点在同源物种间均高度保守。在线生物信息学软件预示两种变异均为有害变异。变异蛋白模型分析显示p.Ser329Pro变异后，Pro侧链与Leu333新增一氢键，且Pro苯环与Glu325产生碰撞力；p.Arg364Gln变异型比Arg364野生型增加了两个氢键，进而导致蛋白质结构改变。 结论:该家系 F7基因第8外显子c.985T>C(p.Ser329Pro)杂合错义变异和c.1091G>A(p.Arg364Gln)杂合错义变异与该家系的FⅦ水平降低有关。

目的:对一例遗传性凝血因子Ⅻ(FⅦ)缺陷症的患者及其家系进行基因分析,探讨其分子发病机制.方法:使用Sysmex-CS5100全自动血凝分析仪检测先证者及其家系成员(共3代8人)的凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间、D-二聚体、纤维蛋白降解产物以及血浆FⅦ的活性(FⅦ:C)水平;PCR法扩增先证者凝血因子Ⅶ基因(F7)所有外显子和侧翼序列,PCR产物纯化后测序,发现突变位点则反向测序给予证实;使用ClustalW软件对突变位点进行保守性分析;应用Mutation Taster和PolyPhen-2在线生物学软件评估突变氨基酸对FⅦ蛋白结构与功能的危害性;运用Swiss软件对突变建模分析.结果:凝血常规检查结果显示,先证者PT单独性延长至42.5 s;FⅦ:C明显降低,仅为2％;同样先证者外婆、母亲和妹妹的FⅦ:C都有轻度降低,分别为49％、51％和42％;父亲各指标均在正常参考范围.基因分析结果显示,先证者F7基因第6号外显子cDNA的646位发生G＞A杂合突变,导致FⅦ催化区的156位甘氨酸被替换为丝氨酸(p.Gly156Ser).F7其他外显子和侧翼序列的测序结果均正常.其外婆、母亲和妹妹均携带c.646G＞A杂合突变,父亲为正常野生型.模型构建显示p.Gly156Ser突变使该位点氨基酸极性发生改变并出现侧链,从而使蛋白的不稳定性增加,可能影响所在结构域的催化活性.同时,Mutation Taster和PolyPhen-2两个在线生物信息学软件也高分预测该突变具有致病性.结论:该遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症患者FⅦ蛋白p.Gly156Ser错义突变与血浆FⅦ:C水平降低有关.

目的 对1个遗传性凝血因子Ⅶ(FⅦ)与因子Ⅹ(FⅩ)联合缺陷症患者进行表型及F7与F10基因突变检测,探讨其分子发病机制.方法 2016年7月12日温州医科大学附属第一医院妇科门诊收治1例48岁子宫肌瘤患者.采集先证者及其家系成员(共3代8人)外周静脉血标本,采用一期凝固法检测其凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、血浆FⅦ活性(FⅦ:C)、FⅩ活性(FⅩ:C)等凝血指标,ELISA法检测FⅦ抗原(FⅦ:Ag)和FⅩ抗原(FⅩ:Ag);用DNA直接测序法分析先证者F7、F10基因的全部外显子、侧翼、5′和3′非翻译区及家系成员相应的突变位点区域,用反向测序证实所发生的突变;采用生物信息学预测软件(SIFT和PolyPhen-2)分析突变对蛋白质功能的影响;以蛋白质数据库(Protein Data Bank)中提供的三维结构(PDB ID:FⅦ,1dan;FⅩ,1xka)为模型,用Swiss-pdbViewer软件程序分析突变位点对FⅦ及FⅩ蛋白分子内氨基酸相互作用的影响.结果 先证者的PT(17.2 s)和APTT(52.4 s)延长,FⅦ:C、FⅦ:Ag与FⅩ:C、FⅩ:Ag下降,分别为42％、55％与35％、43％;母亲、女儿的FⅩ:C分别为40％和42％及FⅩ:Ag分别为43％和47％;父亲、大哥的FⅦ:C、FⅦ:Ag均下降至正常对照的一半左右.测序发现先证者的F7基因第8外显子的c.1238G>A杂合突变导致Arg353Gln多态性,F10基因第4外显子的c.361T>C杂合突变导致Cys81Arg错义突变;父亲、大哥存在F7基因的Arg353Gln多态性及母亲、女儿存在F10基因Cys81Arg错义突变.生物信息学软件预测结果表明Cys81 Arg错义突变可影响蛋白质的功能.蛋白模型分析发现:FⅩ蛋白第81位不带电荷的Cys被带正电荷的Arg取代后,其Cys81与Cys72间的二硫键消失,并且产生空间位阻效应;FⅦ蛋白第353位带正电荷的Arg被不带电荷的Gln取代后,Arg353与Tyr352间的氢键消失.结论 该遗传性凝血因子Ⅶ与Ⅹ联合缺陷症家系先证者的F7基因存在Arg353Gln多态性及F10基因存在Cys81Arg杂合错义突变,且分别遗传自父亲和母亲.F10基因Cys81Arg为国际上鲜见报道的突变,其和F7基因Arg353Gln多态性与该家系的FⅩ和FⅦ水平降低有关.

目的 分析1例凝血因子Ⅹ (coagulable factor Ⅹ,FⅩ)缺陷症家系的表型及基因型,并探讨F10基因突变与表型的关系.方法 用一期凝固法测定先证者及其家系成员的凝血酶原时间(prothrombin time,PT)、活化部分凝血酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)、纤维蛋白(fibrinogen,FIB)及血浆FⅡ活性(FⅡactivity,FⅡ∶C)、血浆FⅦ活性(FⅦactivity,FⅦ∶C)、血浆FⅨ活性(FⅨactivity,FⅨ∶C)、血浆FⅩ活性(FⅩ activity,FⅩ∶C)等指标进行表型诊断;用ELISA法检测FⅩ抗原含量(FⅩ antigen,FⅩ∶Ag);用PCR对先证者及其家系成员F10基因8个外显子及其侧翼序列、5'和3'非翻译区进行扩增,产物纯化后直接进行正向和反向测序;同时对100名健康对照DNA相应突变区域测序以排除基因多态性;应用软件分析突变位点序列和蛋白质构象改变特点及同源比对分析.结果 先证者PT、APTT、FⅩ∶C、FⅩ∶Ag均有异常,分别为16.1s、49.0 s、27％、56％,其他凝血表型指标均正常;先证者母亲PT、APTT、FⅩ∶C、FⅩ∶Ag分别为14.8s、37.4s、44％、34％;先证者外祖母PT、APTT、FⅩ∶C、FⅩ∶Ag分别为15.8 s、42.2 s、31％、45％;父亲的凝血指标均正常.先证者、母亲和外祖母均为F10第8外显子g.28076G＞A杂合突变,导致p.Gly363Ser,父亲无此突变.p.Gly363Ser突变导致FⅩ蛋白二级结构和三维空间结构的改变,导致活性降低.结论 该先证者的家系中存在F10遗传性杂合突变g.28076G＞A(p.Gly363Ser),且该突变与FⅩ水平降低有关,为国内尚未见报道的突变.

目的 探讨一个遗传性凝血因子Ⅴ (coagulation factor Ⅴ,FⅤ)缺陷症家系的表型特征及其分子致病机制.方法 在STAGO全自动血凝仪上检测先证者及家系成员(3代6名成员)凝血酶原时间(prothrombin time,PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)、纤维蛋白原(fibrinogen,FIB)、血浆凝血因子Ⅱ活性(coagulation factorⅡactivity,FⅡ∶C)、FⅤ活性(FⅤ activity,FV∶C)、凝血因子Ⅶ活性(coagulation factorⅦactivity,FⅦ∶C)和凝血因子Ⅹ活性(coagulation factor Ⅹactivity,FⅩ ∶C)活性;ELISA方法检测FⅤ抗原(FⅤ antigen,FⅤ∶Ag).采用DNA直接测序法分析先证者F5基因的全部外显子、侧翼序列、5'和3'端非翻译区及家系成员相应的突变位点区域,发现突变位点后用反向测序予以证实.采用ClustalX软件分析突变位点的保守性,同时用生物信息学预测软件(PROVEAN和MutationTaster)分析突变对蛋白质功能的影响,用Swiss-PdbViewer软件对突变位点进行蛋白模型和氨基酸相互作用分析.结果 先证者PT和APTT均稍延长,分别为15.2s和41.8 s,FⅤ∶C和FⅤ∶Ag降低,分别为55％和62％;其父亲和儿子FⅤ∶C和FⅤ∶Ag也均有不同程度下降(分别为60％、65％和31％、40％).先证者F5基因第6外显子上发现c.911G＞A杂合突变,导致Gly276Glu;其父亲和儿子也为Gly276Glu杂合子;母亲、哥哥和丈夫为正常野生型.保守性分析结果表明,Gly276在同源物种间高度保守;两个生物信息学软件对该突变的预测结果一致:PROVEAN(评分-6.214分)结果预示为有害突变;MutationTaster(评分0.976分)结果预示可引起相应疾病;突变蛋白模型分析显示,在野生型蛋白质中,Gly276的主链与Ile298之间有两个氢键,当Gly276突变为Glu276后,原有的氢键没有改变,但由于Glu侧链延长,与周围氨基酸之间增加了空间位阻,导致蛋白质稳定性下降.结论 该先证者F5基因第6外显子存在c.911G＞A杂合突变,导致Gly276Glu,此突变遗传自父亲,且与该家系FⅤ水平减低有关.

目的 对2例遗传性凝血因子Ⅶ(factorⅦ,FⅦ)缺陷症患者家系进行临床表型和基因变异分析,并探讨其分子发病机制.方法 对先证者F7基因第1～9外显子及其侧翼序列进行PCR扩增、纯化和测序,寻找变异位点,对于新发现的错义变异位点排除多态性后,采用SWISS-MODEL建模,用Pymol软件分析蛋白结构的改变,同时分析该位点氨基酸在物种间的保守性.结果 家系1先证者凝血酶原时间(prothrombin time,PT)、凝血因子Ⅶ活性(FⅦactivity,FⅧ∶C)和凝血因子Ⅶ抗原(FⅦantigen,FⅦ∶Ag)分别为36.3 s、3％和53.56％;测序结果显示先证者F7基因第1外显子c.80 81delCT和第9外显子c.1371G＞T(p.Arg439Ser)的复合杂合变异,其儿子携带c.1371G＞T(p.Arg439Ser)杂合变异.家系2先证者的PT 22.3 s、FⅦ∶C4％和FⅦ∶Ag 1.58％;携带F7基因第3外显子c.278G＞T (p.Arg75Met)和第9外显子c.1278T＞G(p.His408Gln)的复合杂合错义变异,先证者母亲和儿子携带c.278G＞T(p.Arg75Met)杂合变异.三维模拟软件分析提示p.Arg439Ser和p.Arg75Met会引起局部基团氢键的改变,物种间蛋白质同源性分析也表明这两个氨基酸高度保守.结论 F7基因c.1371G＞T(p.Arg439Ser)和c.278G＞T(p.Arg75Met)变异均为未报道过的新变异,推测这两种变异可能会影响Ⅶ因子的功能,可能是两先证者的致病原因.

遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症(hereditary factorⅦ deficiency)是一种常染色体隐性遗传病,系凝血因子Ⅶ(FⅦ)基因突变引起血浆中FⅦ功能发生障碍和(或)含量减少,影响外源性凝血途径的起始阶段从而导致临床出血症状的疾病,男女均可罹患[1].其实验室检查特点:凝血酶原时间延长,活化部分凝血活酶时间正常,FⅦ活性测定减低.该病由Alexander[2]在1951年首次报道,约18％的患者与近亲婚配有关,发病率约为1/50万,是一种少见的遗传性出血性疾病.

目的 对1例遗传性凝血因子Ⅶ(coagulation factorⅦ,FⅦ)缺陷症患者进行凝血指标与基因水平的分析,初步探讨其分子发病机制.方法 用ELISA法检测FⅦ抗原(FⅦantigen,FⅦ∶Ag)及一期凝固法检测凝血酶原时间(prothrombin time,PT)、FⅦ活性(FⅦactivity,FⅦ∶C)等凝血相关指标进行表型诊断;用Sanger测序法分析先证者F7所有外显子、侧翼序列、5'和3'非翻译区及家系成员相应的突变位点区域DNA;采用生物信息学预测软件(SIFT和PolyPhen-2)分析突变对蛋白质功能的影响,用Swiss-pdbViewer软件分析突变位点对FⅦ蛋白分子内氨基酸相互作用的影响.结果 先证者PT明显延长为36.3s,FⅦ∶C和FⅦ∶Ag减低为2％和44％;父亲、母亲、妹妹和女儿的PT均稍延长、FⅦ∶C均较正常对照水平稍减低,父亲及妹妹的FⅦ∶Ag水平稍降低.测序发现先证者F7基因第8外显子存在c.1201A＞G(Lys341Glu)杂合突变和第6内含子的3'端剪接位点突变(IVS6-1G＞ A);父亲、妹妹存在IVS6-1G＞A杂合突变,母亲、女儿存在Lys341Glu杂合突变.生物信息学软件预测结果表明Lys341Glu错义突变可影响蛋白质的功能;蛋白模型分析发现FⅦ蛋白Lys341Glu突变使第341～368位氨基酸的空间构型发生改变.结论 先证者Lys341Glu杂合突变协同IVS6-1G＞A杂合突变是导致其FⅦ缺陷症的分子机制.