贻贝是一类极具经济价值和生态价值的双壳贝类,对其先天免疫防御机制的研究在海洋生物免疫学研究中占据重要地位.血淋巴是贻贝的主要免疫组织,采用贻贝血细胞Nanopore全长转录物组,结合基于SDS-PAGE分析的血清差异蛋白质组学手段,开展了厚壳贻贝血淋巴对不同微生物免疫响应的关键分子挖掘.研究结果表明,在不同微生物诱导后的贻贝血清中,共鉴定到蛋白质44种,其中26种蛋白质表现为在不同微生物胁迫后具有与对照组相比的显著差异表达(P＜0.05),其功能涉及蛋白质折叠保护、细胞自噬与凋亡的调节、活性氧产生、能量代谢调节、细胞解毒功能以及炎症反应调节等.上述蛋白质在不同细菌和真菌胁迫后,其在血细胞中的基因表达量变化趋势存在差异,反映出贻贝对不同细菌和真菌诱导具有不同的响应策略.上述研究结果为了解贻贝先天免疫系统在应对不同类别微生物侵袭过程中,其差异化免疫响应机制,以及贻贝在微生物感染后,特异性标志蛋白质的筛选提供了新的科学依据,也为后续贝类养殖业的健康发展和病害防治提供了思路.

为探究养殖网箱表面涂层对海洋污损的防污性能,研究在Glass基底上以聚二甲基硅氧烷(Poly-dimethylsiloxane,PDMS)为成膜剂,填充不同浓度(3.5wt％、7.5wt％、11.25wt％、15wt％)的ZnO纳米粒子,采用流延法制备ZnO/PDMS涂层后,将基底投放于浙江嵊泗枸杞岛自然海域(30.72 °N,122.76 °E),测试该涂层表面所成生物被膜情况,及其对厚壳贻贝稚贝附着的影响.结果显示:生物被膜的生物量随基底投放时间的增加而增加.在28d时,填充ZnO纳米粒子各实验组生物被膜的细菌密度、硅藻密度及其对厚壳贻贝稚贝附着的诱导能力显著低于未添加组.与Glass相比,15 wt％ZnO/PDMS上28d生物被膜细菌密度下降了43.25％、硅藻密度下降了91.59％;厚壳贻贝稚贝附着率同比Glass组及PDMS组分别下降了75.41％和62.50％.利用MiSeq测序技术评估15wt％ZnO/PDMS上28d生物被膜群落结构发现,与Glass相比,ZnO/PDMS通过降低嗜冷杆菌属(Psychrobacter)相对丰度,提高罗氏菌属及维诺格拉德斯基氏菌属(Winogradskyella)相对丰度,改变了细菌群落的组成.因此,ZnO/PDMS通过降低生物被膜的生物量及改变细菌群落结构丰度来影响自然生物被膜的形成,并抑制了厚壳贻贝稚贝的附着.

为了解尿素对厚壳贻贝在海洋酸化条件下,其贝壳损伤-修复过程的影响,通过构建酸化条件下厚壳贻贝的壳损伤模型,结合外套膜转录组学技术,分析了厚壳贻贝外套膜在尿素添加前后的转录组学响应;进一步对两种条件下的厚壳贻贝外套膜开展了显微观察、游离氨基酸组成变化及细胞内钙离子水平分析.结果表明,尿素的添加有助于贻贝外套膜在酸化背景下其细胞稳态维持、能量代谢水平提升、免疫平衡调节及钙离子募集等功能.上述研究有助于了解厚壳贻贝在海洋酸化背景下其贝壳的生物矿化过程及壳损伤-修复分子策略,从中判断尿素添加对贻贝在海洋酸化条件下的贝壳生物矿化过程的可能促进机制,也为在当前海洋酸化大背景下,海洋贝类养殖业的健康发展提供了新的思路.

贻贝足丝及其足丝蛋白相关研究对于开发新型水下生物粘附剂具有重要的仿生学意义.足丝蛋白在其粘附过程中需要维持一定的还原态,而目前已报道的足丝抗氧化蛋白仅有MFP-6.此前在厚壳贻贝足丝中鉴定到一种新型的富含半胱氨酸和甘氨酸的足丝蛋白质,该蛋白质被命名为Cys/Gly-Rich-Protein (CGRP),但是CGRP蛋白在足丝中的作用及机制尚不明确.为此,针对CGRP蛋白,在序列分析基础上,利用原核重组表达手段获得其重组蛋白质,采用2,2-联苯基-1-苦基肼基(2,2-diphenyl-1-picryl hydrazyl radical,DPPH)法检测CGRP重组蛋白经不同条件处理后的抗氧化活性.序列分析结果表明,CGRP蛋白含16.5％的半胱氨酸和10％的甘氨酸,其序列中含有两段半胱氨酸位置保守的重复序列,结构预测表明,其优势构象以无规卷曲为主.同源蛋白质搜索结果表明,CGRP蛋白在数据库中尚无高同源性蛋白质存在.通过密码子优化结合原核重组表达策略成功表达出CGRP重组蛋白,所获得的CGRP重组蛋白具有明显的抗氧化活性,且该活性在其半胱氨酸还原后显著增强(0.91±0.05 vs 0.71±0.11,P＜0.01)而在半胱氨酸烷基化之后显著下降(0.08±0.03 vs 0.71±0.11,P＜0.01),表明CGRP蛋白的抗氧化活性与其序列中半胱氨酸的自由巯基有关.本研究提示,CGRP蛋白是足丝中一种新的具有抗氧化功能的蛋白质,在足丝粘附过程中推测与MFP-6一起参与了富含多巴的足丝粘附蛋白的还原态维持,对贻贝足丝在固化和粘附过程中防止提前粘附具有重要意义.

贻贝素(Mytilins)是一类主要在贝类血细胞中表达的阳离子小分子抗菌肽,包括多种同工型,它们在免疫系统中发挥了重要作用,Mytilin-1是其中的一种同工型.厚壳贻贝(Mytilus coruscus)Mytilin-1的一级结构由信号肽、成熟肽和C端的延伸肽组成;其成熟肽决定了Mytilin-1的生物学活性,它由34个氨基酸残基组成,其中8个保守的半胱氨酸残基在空间上能形成4对二硫键,对Mytilin-1的稳定性和活性起了关键作用.以厚壳贻贝的Mytilin-1成熟肽为重组DNA表达的目的蛋白,根据毕赤酵母(Pichia pastoris)的密码子偏爱性对编码该成熟肽的密码子进行优化,合成的目的基因"mMy1"与表达载体pPICZαA连接后电转至毕赤酵母X-33,通过高浓度博来霉素筛选高拷贝酵母转化子,获得的阳性转化子在29℃、250 r/min、pH6.0的条件下,使用1％ 甲醇诱导表达96 h;培养液上清经Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析证明:重组mMy1在毕赤酵母X-33中得到成功表达,其分子量为4.8 kD.抑菌试验表明,重组mMy1对革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)以及革兰氏阴性的大肠杆菌(Escherchia coli)具有抑菌活性.

贝壳是一种具有优异力学性能的生物硬组织,贝壳基质蛋白质对贝壳的形成具有重要意义.厚壳贻贝(Mytilus coruscus)贝壳中发现一种类似胶原蛋白质的新型贝壳基质蛋白质,命名为collagen-like protein 2(CLP-2).然而,该蛋白质的结构与功能以及对贝壳形成的影响机制尚不清楚.为此,本研究对CLP-2开展了序列分析;进一步采取密码子优化结合原核重组表达策略,开展了CLP-2的重组表达;在此基础上分析了重组CLP-2对酸钙结晶的诱导、结晶速率抑制以及碳酸钙结合能力.对CLP-2的序列分析结果表明,该蛋白质序列中含有信号肽及两个Von Willebrand factor A(VWA)结构域.CLP-2在数据库中尚无高同源性蛋白质存在,表明这是一种较为新颖的贝壳基质蛋白.所获得的重组CLP-2对碳酸钙体外结晶表现出明显的诱导作用,扫描电镜以及傅里叶红外光谱结果表明,重组CLP-2可诱导碳酸钙晶体的形貌由立方体形转化为球形,并在高浓度下进一步转化为哑铃形;同时,重组CLP-2可促使碳酸钙晶体的晶型由方解石型向文石型转化;重组CLP-2在体外具有碳酸钙晶体结合作用;此外,重组CLP-2能显著抑制碳酸钙晶体的结晶速度(P＜0.01),并具有浓度依赖性.上述结果表明,厚壳贻贝贝壳CLP-2蛋白质在贝壳,特别是文石型肌棱柱层的生物矿化过程中具有重要作用.上述研究为深入了解贻贝贝壳的形成机制,以及胶原类蛋白质对生物矿化过程的影响奠定了基础.

贝壳历来是生物工程和材料学研究的重要对象.贝壳中的贝壳基质蛋白质在贝壳的形成与发育过程中具有重要的调控作用.Whirlin类蛋白质(Whirlin-like protein,WLP)是一种从厚壳贻贝(Mytilus coruscus)中鉴定的新型贝壳基质蛋白质.序列分析结果显示,该蛋白质含有PDZ(postsynaptic density/Discs large/Zonula occludens)结构域,而该结构域对贝壳生物矿化的影响目前尚无报道.为深入了解WLP在贝壳形成中对碳酸钙晶体的影响,在序列分析基础上,采用密码子优化结合原核重组表达,获得其重组表达产物后,开展了重组WLP对碳酸钙晶体形貌及晶型的影响研究,结晶速度抑制以及碳酸钙晶体结合分析.分析结果表明,重组WLP能诱导文石型碳酸钙晶体的形貌和方解石型碳酸钙晶体的晶型发生改变;同时重组WLP对碳酸钙晶体具有结合作用,且能抑制碳酸钙晶体的结晶速度.上述结果表明,WLP对贝壳的形成及发育具有重要影响,并可能在贝壳肌棱柱层的形成中发挥了重要作用.

目的 建立适于规模化生产的贻贝多糖制备工艺.方法 以厚壳贻贝为对象,对贻贝多糖制备过程中原料筛选、浸提条件、除蛋白质、醇沉等技术环节进行改进和优化.最后利用改进的工艺进行了贻贝多糖的中试制备.结果 厚壳贻贝多糖为白色粉末,多糖平均得率为贻贝干质量的14.1％.MP-A为厚壳贻贝多糖的主要成分,占比约为89.42％,相对分子质量为1 268.15 kD.结论 建立了流程简单、绿色环保、易于放大的贻贝多糖工业化制备工艺,能获得纯度90％左右的贻贝多糖样品.

为了探讨高温胁迫对厚壳贻贝生理代谢和免疫功能的影响,测定了不同温度胁迫水平(20→25℃;20→30℃)下厚壳贻贝的滤水率、耗氧率、排氨率以及不同组织己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性.结果 表明:25℃胁迫3h后厚壳贻贝滤水率升高至0.56 L·g-1·h-1,但与对照组相比无显著变化,30℃处理后滤水率则显著降低;高温胁迫处理后,厚壳贻贝的耗氧率与排氨率均显著升高,25℃与30℃处理组间耗氧率无显著差异,但30℃处理组排氨率显著低于25℃;与对照组相比,外套膜和鳃HK活性无显著变化,但肝胰腺HK活性显著降低,鳃部HK活性显著高于外套膜和肝胰腺;外套膜PK活性显著升高,在30℃达到最大值,而25℃胁迫处理组鳃PK活性却显著降低;高温胁迫后外套膜ACP活性显著降低,25℃处理组肝胰腺ACP活性显著降低,但各处理组间鳃ACP活性无显著差异;25℃下外套膜AKP活性显著升高,30℃时鳃和肝胰腺AKP活性显著低于对照组;30℃胁迫下外套膜SOD活性显著升高,鳃和肝胰腺SOD活性无显著变化,肝胰腺SOD活性显著低于鳃和外套膜.实验表明,一定温度变化范围内,厚壳贻贝可通过调节自身代谢水平应对温度升高带来的胁迫,但短时间内大幅升温显著影响厚壳贻贝的摄食、代谢和免疫反应.厚壳贻贝代谢酶和免疫酶活性具有组织特异性.

组氨酸二肽是以β-丙氨酸为前体的生物转化产物,在生物体内广泛存在,发挥着重要的生理功能,并在医药及食品领域具有重要应用价值.厚壳贻贝是我国重要的经济贝类,但厚壳贻贝体内的组氨酸二肽含量及肌肽代谢相关酶在β-丙氨酸补充前后的动态变化尚不明确.本研究测定了厚壳贻贝组氨酸二肽含量及其代谢相关基因的表达.邻苯二甲醛法结合氨基酸组成分析法测定结果表明,厚壳贻贝体内各组织均含有组氨酸二肽.其含量在4～ 10μg/g干组织.其中,鹅肌肽含量较高;β-丙氨酸补充后,厚壳贻贝中各组织的组氨酸二肽含量在后闭壳肌和外套膜中上升约1.5倍.其中,鹅肌肽含量上升明显;荧光实时定量PCR结果发现,肌肽合成酶和肌肽酶在厚壳贻贝各组织均有表达,其表达量在β-丙氨酸补充后明显上调.进一步的酶活力测试结果表明,β-丙氨酸补充120 min后,肌肽合成酶和肌肽酶的酶活明显上调(P＜0.01).上述研究结果对深入了解组氨酸二肽在贻贝体内的生理学功能及其代谢过程具有重要意义,也为水产养殖业中利用β-丙氨酸补充作为提升养殖效率和养殖品种营养价值的手段提供了科学依据.