目的:探讨磷酸钙骨水泥（CPC）支架负载大黄素（EMO）对成骨细胞成骨活性的影响。方法:首先制备骨水泥支架，将EMO粉末与CPC粉末（1∶9）均匀混合，加入柠檬酸搅拌后，注入聚四氟乙烯模具（EMO-CPC组）；将0.36 g CPC粉末加入柠檬酸搅拌后，注入聚四氟乙烯模具（CPC组）。比较两组大体形貌、凝结时间（初凝时间和终凝时间）、可注射率及压缩强度。提取原代成骨细胞，并与两组支架共培养，通过扫描电镜观察两组共培养3 d后的表征；通过细胞活性与毒性检测试剂盒行活/死细胞染色和3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴（MTT）比色法检测两组细胞存活率、毒性及增殖活力，并对两组支架行骨桥蛋白（OPN）免疫荧光染色，于倒置荧光显微镜下观察OPN蛋白荧光表达情况；共培养7 d后，通过四唑硝基蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐（NBT/BCIP）染色法行碱性磷酸酶（ALP）染色，观察两组成骨活性；共培养14 d后，采用茜素红染色法检测两组成骨活性。结果:两组支架扫描电镜下均呈现相对光滑平整的形貌结构。EMO-CPC组初凝时间、终凝时间、可注射率及压缩强度与CPC组比较，差异无统计学意义（ P > 0.05）。扫描电镜显示，共培养3 d后成骨细胞集簇黏附于EMO-CPC支架表面，形态良好；EMO-CPC组细胞存活率达（98.2 ± 0.1）%，CPC组为（90.2 ± 0.1）%（ P < 0.05）；EMO-CPC组细胞增殖活力较CPC组更强（ P < 0.05）。OPN特异性染色显示，EMO-CPC组OPN蛋白荧光表达更强；共培养7 d后，EMO-CPC组ALP表达高于CPC组。共培养14 d后，EMO-CPC组茜素红染色强度更为显著，成骨活性更强。 结论:EMO-CPC支架较CPC支架具有更好的生物相容性、细胞增殖能力及成骨活性，为成骨细胞的生长提供了适宜的环境。

目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、骨形态发生蛋白(BMP)-12基因序贯转染兔脂肪干细胞向成纤维细胞分化的可能性。方法:2017年1月至2018年12月，原代培养兔脂肪干细胞(取自新西兰大耳兔颈背部皮下脂肪)，细胞表面抗原CD44、CD49d、CD106检测结合成骨细胞诱导分化对培养的细胞进行鉴定，脂质体介导的方法序贯转染BMP-12和bFGF基因，蛋白质印迹法(Western blot)检测目的基因BMP-12和bFGF蛋白的表达；实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测转染细胞Ⅰ型胶原和弹性蛋白RNA的表达情况。符合正态分布的计量资料以均数±标准差( ± s)表示，应用单因素方差分析比较组间差异。 结果:兔脂肪组织中分离出来的脂肪间充质干细胞(ADSCs) CD44、CD49d表达阳性，CD106表达呈阴性。Western blot检测筛选后的ADSCs稳定表达BMP-12(0.229±0.005)和bFGF(0.208±0.019)蛋白( F＝120.221， P<0.05)，差异有统计学意义。双基因转染的ADSCsⅠ型胶原(2.250±0.007， F＝340.103， P<0.05)和弹性蛋白(1.807±0.008， F＝107.314， P<0.05)的mRNA表达最高，差异均有统计学意义。 结论:pcDNA3.1＋绿色荧光蛋白(GFP)-BMP-12和pcDNA3.1＋红色荧光蛋白(RFP)-bFGF可以促进ADSCs向成纤维细胞分化，可能在组织工程技术修复韧带损伤中具有重要作用。

目的:探讨钽涂层金属在体外促进大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)黏附、增殖及成骨分化方面的作用。方法:在体外取6只6周龄SD大鼠BMSCs进行原代培养至第3代，使用化学气相沉积系统自行制备钽涂层金属。然后进行流式细胞术鉴定、BMSCs三向诱导、荧光染色、细胞增殖检测及实时荧光定量聚合酶链反应技术(Q-PCR)试验。观察比较BMSCs在钛合金圆片（Ti6Al4V组）和钽金属圆片（Ta组）表面黏附的BMSCs数量、增殖速率、成骨细胞特异性转录因子(OSX)、Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨粘连蛋白(OSN)和骨桥蛋白(OPN)的表达情况。结果:流式细胞术结果显示CD44 (94.55%)、CD90 (95.01%)、CD34 (0.06%)。诱导成骨分化14 d后碱性磷酸酶(ALP)染色阳性；诱导成骨分化21 d后出现茜素红钙化结节；成脂诱导21 d后油红O染色呈阳性；成软骨诱导21 d后阿利新蓝染色评估有软骨形成能力。激光共聚焦显微镜结果显示BMSCs在Ti6Al4V组和Ta组金属圆片表面贴附生长，细胞间互相接触、聚集成片，Ta组金属圆片上黏附的BMSCs数量明显多于Ti6Al4V组，并且具有更好的延展性能。细胞增殖检测结果发现，分别共培养1、3、5、7 d后Ta组BMSCs的增殖速率明显快于Ti6Al4V组，差异均有统计学意义( P<0.05)。Q-PCR结果发现，与Ti6Al4V组相比，体外培养7 d后Ta组金属圆片更能促进OSN和OPN的表达，差异有统计学意义( P<0.05)；体外共培养21 d后，Ta组金属圆片更能促进OSX、RUNX2、OSN和OPN的表达，差异均有统计学意义( P< 0.05)。 结论:相比于传统的骨科植入物钛合金而言，钽涂层金属能够更好地促进BMSCs的黏附，增殖和成骨分化。

目的:明确多聚嘧啶序列结合蛋白(polypyrimidine tract binding protein, PTB)在正常人和骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)成骨分化中的作用及其机制。方法:收集中国医学科学院整形外科医院收治的4例齿槽嵴裂患儿术后废弃骨髓血，原代分离培养人BMSCs并诱导分化为成骨细胞，RT-PCR和蛋白质印迹法检测PTB在诱导分化7 d和14 d的表达水平；应用shRNA技术对人BMSCs中PTB的表达进行敲减，茜素红染色和荧光定量PCR评价其对成骨分化的影响；体外分别应用浓度为10 ng/ml和40 ng/ml的肿瘤坏死因子α(TNF-α) 处理人BMSCs，荧光定量PCR和茜素红染色检测其对PTB表达及成骨分化能力的影响；流式细胞术检测人BMSCs经PTB敲减后细胞内活性氧(ROS)含量。10只6个月龄雌性SD大鼠采用随机数字表法随机分为卵巢切除骨质疏松模型组和假手术组，每组5只，荧光定量PCR检测其BMSCs中PTB的表达变化。各项定量数据以均值±标准差表示，2组间比较应用 t检验， P<0.05为差异具有统计学意义。 结果:BMSCs成骨诱导分化7 d和14 d PTB表达显著升高，敲减PTB并成骨诱导14 d后，成骨标志基因 RUNX2和 ALP相对表达量显著下降，分别为对照组的0.74±0.15和0.29±0.18倍( t＝3.490、 P＝0.039， t＝7.983、 P＝0.004)，且茜素红染色阳性的矿化结节形成减少。10 ng/ml TNF-α( t＝3.528, P＝0.039)和40 ng/ml TNF-α( t＝4.306, P＝0.023)均下调BMSCs中PTB表达，并抑制成骨分化。敲减PTB后BMSCs细胞内ROS含量(720.7±129.7)较对照组(1 204.0±300.1) 下降，差异具有统计学意义( t＝4.872, P＝0.040)。相比于假手术组(0.001 66±0.000 18)，卵巢切除骨质疏松模型大鼠BMSCs中PTB的相对表达量(0.001 25±0.000 12)显著降低( t＝3.217, P＝0.032)。 结论:PTB的表达可促进BMSCs成骨分化，PTB敲减介导的ROS含量下调是其调控BMSCs成骨分化的一个重要机制。

目的:观察原代成骨细胞来源胞外囊泡(OB-EV)对破骨细胞增殖、分化的作用,探究胞外囊泡参与成骨细胞和破骨细胞之间通信的可能分子机制.方法:采用酶消化法分离原代成骨细胞,并以β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、地塞米松成骨诱导液诱导培养,通过碱性磷酸酶染色及茜素红S染色鉴定成骨细胞分化及矿化功能.收集成骨细胞培养上清液,采用超速离心法提取囊泡分泌物,并通过透射电镜观察囊泡形态,蛋白质印迹法鉴定胞外囊泡表面特征性标志物肿瘤易感基因101(TSG101)、ALG-2相互作用蛋白X(Alix)和分化抗原9(CD9).采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)实验检测OB-EV对RAW264.7的增殖作用.进一步通过蛋白质印迹法检测OB-EV与核因子κB受体活化因子配体(RANKL)联合作用后RAW264.7破骨分化标志物的表达水平.将OB-EV处理的小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMM)通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察并比较破骨细胞数,明确OB-EV对破骨细胞分化的影响.结果:透射电镜观察提取的OB-EV呈直径为30～150 nm的双层杯状结构,且TSG101、Alix、CD9呈阳性表达.CCK-8实验结果显示高浓度(20 μg/mL以上)OB-EV抑制RAW264.7增殖(P<0.05).蛋白质印迹法检测发现RAW264.7中c-Fos、活化T细胞核因子(NFATc1)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)等破骨细胞分化标志蛋白表达明显增加,且随OB-EV浓度增加而增加(P<0.05).此外,将OB-EV与RANKL联合作用于BMM,结果显示TRAP阳性细胞较RANKL对照组显著增多(P<0.05).结论:OB-EV可促进破骨前体细胞向破骨细胞分化,但高浓度OB-EV会抑制细胞增殖.

背景 破骨细胞外泌体参与细胞间通讯,在骨重塑中起重要作用.前体破骨细胞(precursor osteoclast,pOC)外泌体和成熟破骨细胞(mature osteoclast,mOC)外泌体对成骨细胞分化的作用是否存在差异,仍待进一步研究.目的 探究前体破骨细胞和成熟破骨细胞外泌体对成骨细胞分化的作用.方法 利用核因子κB配体受体活化因子和巨噬细胞集落刺激因子刺激骨髓单核/巨噬细胞,诱导破骨细胞分化成熟.提取pOC和mOC分泌的外泌体,对两种外泌体进行表征.分别用两种外泌体干预原代乳鼠颅骨成骨细胞并进行成骨诱导分化,利用荧光标记观察外泌体摄取情况;使用茜素红S(alizarin red S,ARS)染色、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色和RT-qPCR评价两种外泌体对成骨分化能力的影响.结果 mOC相较于pOC具有更典型的多核融合结构;两种细胞外泌体粒径均为 100 nm左右,呈圆形盘状,表达外泌体标志性蛋白,均可被原代成骨细胞摄取.mOC外泌体干预组ARS染色钙结节数量与ALP染色深度均高于pOC外泌体干预组(P＜0.05);mOC外泌体干预组成骨相关基因的表达高于pOC组和对照组(P＜0.05).结论 成熟破骨细胞外泌体相较于前体破骨细胞外泌体,促成骨细胞分化能力可能更强.

背景 骨骼肌衰老后质量和功能逐渐下降,其分泌的外泌体对骨代谢具有明显的影响,但衰老骨骼肌外泌体对骨代谢的调控机制尚未明确.目的 探索衰老骨骼肌组织外泌体调控成骨、破骨细胞功能的作用.方法 将2月龄(Young)和24月龄(Old)小鼠骨骼肌组织消化形成单细胞悬液,从中提取的骨骼肌组织外泌体分别为年轻骨骼肌组织外泌体(Young-Exo)和衰老骨骼肌组织外泌体(Old-Exo).通过生物透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)、纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)和Western blot对外泌体进行验证.利用提取的外泌体干预诱导原代成骨细胞成骨分化和诱导骨髓单核巨噬细胞向破骨细胞分化.组织外泌体干预实验分为对照组(PBS组)、年轻组织外泌体组(Young-Exo 组)、衰老组织外泌体组(Old-Exo组).茜素红(alizarin red S,ARS)染色和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色检测成骨分化水平;抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphase,TRAP)染色检测破骨细胞面积;实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测 Alp、Opn、Ocn、Col1a1、Runx2、Ctsk、Dc-stamp、Atp6v0d2、Mmp-9、Acp5 基因相对表达量.结果Young-Exo组与Old-Exo组的细胞外囊泡均为双层膜结构的圆形囊泡,直径110nm左右,且均表达CD9、CD63、CD81和TSG101等外泌体相关标志蛋白.组织外泌体干预诱导原代成骨细胞成骨分化实验结果显示,与PBS组、Young-Exo组比较,Old-Exo组原代成骨细胞ARS染色的钙盐沉积量和ALP染色强度均下降(P＜0.01),成骨分化基因 Alp、Opn、Ocn、Collal、Runx2的mRNA相对表达量降低(P＜0.01);组织外泌体干预诱导骨髓单核巨噬细胞向破骨细胞分化结果显示,与PBS组、Young-Exo组比较,Old-Exo组TRAP染色的破骨细胞所占面积百分比升高(P＜0.01),破骨细胞相关基因Ctsk、Dc-stamp、Atp6v0d2、Mmp-9、Acp5的mRNA相对表达量升高(P＜0.01).结论 与年轻骨骼肌组织外泌体相比,衰老骨骼肌组织外泌体可能通过抑制原代成骨细胞的成骨分化、促进破骨细胞形成,打破骨代谢的动态平衡,导致骨质疏松症.

目的:研究IDH1突变在软骨肿瘤发生过程中对软骨分化能力的影响.方法:利用Sanger测序法,检测收集的人软骨肿瘤石蜡标本中IDH1的突变情况;诱导小鼠胚胎间充质干细胞向成骨细胞分化,转染IDH1 R132H位点突变的质粒,观察细胞分化情况;分离培养IDH1突变小鼠的原代软骨细胞,Real-time PCR方法检测软骨分化标志分子Sox9和Col-Ⅱ以及软骨细胞肥大标志分子Runx2和Col-X基因的表达水平;构建软骨组织特异性突变的IDH1-KI小鼠,采用阿尔新蓝-茜素红全骨架染色,研究IDH1突变如何影响软骨细胞的分化功能.结果:IDH1突变是软骨肿瘤中常见的遗传学改变;IDH1 R132H位点突变之后,细胞分泌的2-HG浓度显著增高;加入成骨细胞分化诱导液之后,胚胎间充质干细胞能够向成骨细胞分化,而当IDH1 R132H位点突变后,干细胞无法正常分化;IDH1突变小鼠的软骨细胞中,软骨分化标志性分子Sox9和Col-Ⅱ基因表达无差异,然而软骨细胞肥大标志性分子Runx2和Col-X基因表达显著高于野生组小鼠,利用5 mmol/L的2-HG刺激模拟IDH1突变,得到相似结果;IDH1-KI小鼠整个骨骼中软骨含量明显增多,且有明显的骨化异常.结论:IDH1突变促进了软骨细胞的生长,抑制了软骨到成骨的分化过程.

目的 观察 Beclin 1 野生型、突变型质粒对成骨细胞自噬-凋亡表达的影响.方法 采用原代分离培养的大鼠颅骨成骨细胞,构建Beclin 1 突变型质粒转染成骨细胞(MUT)和野生型质粒转染成骨细胞(WT),使用自噬激活剂rapamycin(Rapa)、自噬抑制剂Baf-A1(Baf)和Beclin1/Bcl2 结合抑制剂mifepristone(Mif)干预细胞,分为NC组、Beclin1 WT组、Beclin1 WT+Baf-A1 组、Beclin1 WT+mif组、Beclin1 Mut组、Beclin1 Mut+Rapa组.使用免疫共沉淀检测Beclin1-Bcl2 复合物结合水平,通过MDC染色、溶酶体染色、流式检测、线粒体膜电位检测、Hoechest染色、免疫荧光、WB分别检测成骨细胞的自噬和凋亡表达情况.结果 免疫共沉淀检测:与NC组相比,MUT组中Beclin1-Bcl2 复合物水平显著降低(P＜0.05);MDC染色显示:相对于NC组,WT细胞中溶酶体染色明显增加;细胞凋亡方面:与NC组相比,WT组、WT+Mif组细胞凋亡率显著上升,MUT细胞凋亡率低于WT细胞,比较差异具有统计学意义;JC-1检测显示:与NC组相比,WT细胞的线粒体跨膜电位异常改变,而MUT细胞样本的跨膜电位表达活跃.结论 ①Beclin 1 的过表达可以抑制Beclin 1-Bcl2 复合物的生成;②Beclin 1 是参与自噬的重要基因,适度的Bcilin 1 表达有利于维持细胞群的代谢平衡,Beclin 1 的过表达对细胞自噬无明显影响;③Beclin 1 过表达能抑制成骨细胞凋亡.

目的 探讨脂联素对外周循环RANKL/OPG的调节作用,及对糖尿病性骨质疏松的治疗作用.方法 使用高脂饮食联合链脲佐霉素构建糖尿病性骨质疏松模型小鼠,使用脂联素治疗,使用阿仑膦酸钠治疗作为阳性对照.分组为:对照组、模型组、治疗组、阳性对照组.完成干预后,测量小鼠体重,收集小鼠静脉血并检测空腹血糖水平、葡萄糖耐量试验、血清RANKL/OPG.分别从各组小鼠股骨提取原代骨髓间充质干细胞,诱导成骨分化并茜素红染色,检测Opg、Rankl基因的表达量.获得小鼠腰3椎体,检测各组小鼠骨微细结构变化.结果 脂联素治疗后,与模型组相比,治疗组体重明显下降,空腹血糖水平明显下降,葡萄糖耐量试验明显接近正常水平,血清OPG水平上升,血清RANKL水平下降,血清RANKL/OPG下降.与对照组相比,模型组骨髓间充质干细胞成骨能力明显减弱,显著上调RANKL/OPG;与模型组相比,治疗组骨髓间充质干细胞成骨分化能力明显增强,显著下调RANKL/OPG.脂联素治疗后能显著提高单位长度成骨细胞数量、骨小梁面积百分数、骨小梁厚度.结论 脂联素能够降低糖尿病小鼠体重,降低空腹血糖,部分恢复机体的血糖调节能力,促进Opg基因的表达,抑制Rankl基因的表达,促进骨髓间充质干细胞成骨分化,改善骨微细结构,是一种潜在的治疗糖尿病性骨质疏松的选择.