目的:分离可裂解烧伤患者泛耐药肺炎克雷伯菌的噬菌体，研究其生物学特性、基因组信息及对细菌生物膜的作用。方法:(1)2018年，取分离自上海交通大学医学院附属瑞金医院(下称瑞金医院)烧伤患者血液的泛耐药肺炎克雷伯菌UA168(下称宿主菌)液，采用污水共培养法及滴板法和双层琼脂平板法，从瑞金医院污水中分离纯化得到烧伤患者泛耐药肺炎克雷伯菌噬菌体，将其命名为噬菌体KP168，观察其噬菌斑形态。(2)取噬菌体KP168液行氯化铯密度梯度离心和透析后，采用磷钨酸负染法通过透射电子显微镜观察噬菌体KP168形态。(3)取噬菌体KP168液，采用滴板法检测其对从瑞金医院烧伤患者血液中分离得到的20株泛耐药肺炎克雷伯菌的裂解能力，计算裂解率。(4)分别以感染复数为10.000、1.000、0.100、0.010和0.001共同常规振荡培养初始效价为9.3×10 11噬菌斑形成单位(PFU)/mL噬菌体KP168液(每管400 μL)和浓度为1×10 9集落形成单位(CFU)/mL宿主菌液(每管4 mL)4 h(每种感染复数1管)，采用双层琼脂平板法测算噬菌体KP168效价(测算方法下同)以筛选最佳感染复数，实验重复3次。(5)以感染复数为0.005混合浓度为1×10 9 CFU/mL宿主菌液(每管4 mL)和效价调整为5×10 7 PFU/mL噬菌体KP168液(每管400 μL)，分别于混合后0(即刻)、1、2、3、4、5、15、30 min(每个时间点1管)采用双层琼脂平板法计数噬菌斑(计数方法下同)，计算已吸附噬菌体百分比以筛选最佳吸附时间，实验重复3次。(6)以感染复数为0.005混合浓度为1×10 9 CFU/mL宿主菌液(每管300 μL)和效价调整为5×10 8 PFU/mL噬菌体KP168液(每管60 μL)，静置最佳吸附时间后常规振荡培养，分别于培养0(即刻)、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 min测算噬菌体KP168效价，绘制一步生长曲线，实验重复3次。(7)取效价为2.5×10 10 PFU/mL噬菌体KP168液，分别于37、40、50、60、70 ℃静置培养1 h(每个时间点3管，每管1 mL)，计数噬菌斑并绘制热稳定曲线。取效价为3.0×10 10 PFU/mL噬菌体KP168液，分别加入pH值为5.0、6.0、7.0、7.4、8.0、9.0、10.0的SM缓冲液于37 ℃静置培养1 h(每种pH值3管，每管含100 μL噬菌体KP168液、900 μL SM缓冲液)，计数噬菌斑并绘制酸碱稳定曲线。(8)取噬菌体KP168液同实验(2)透析后行DNA抽提与测序，用Prokka对全基因组进行注释以获得噬菌体KP168编码序列，使用Nucleotide BLAST功能进行核酸序列比对以寻找与噬菌体KP168核酸序列相似度最高的已知噬菌体，使用Blastx功能将编码序列翻译成蛋白质后进行功能预测，比对抗性基因数据库和毒力因子数据库。(9)于96孔板中，分别以感染复数为1.000、0.100、0.010和0.001，在浓度为1.5×10 8 CFU/mL(浓度下同)的200 μL宿主菌液中加入初始效价为5.8×10 10 PFU/mL噬菌体KP168液20 μL(每种感染复数3孔)共同培养48 h；将200 μL宿主菌液静置培养48 h后，分别加入效价为1×10 6、1×10 7、1×10 8、1×10 9、1×10 10 PFU/mL的噬菌体KP168液20 μL(每种效价3孔)静置作用4 h。2种实验均以200 μL宿主菌液中加入SM缓冲液20 μL(3孔)为阴性对照，以220 μL LB培养液(3孔)为空白对照，均采用酶标仪测定吸光度值并分别计算生物膜抑制率和生物膜破坏率，实验均重复3次。 结果:(1)成功分离纯化噬菌体KP168，其噬菌斑透亮，呈圆形，直径约1.5 mm。(2)噬菌体KP168呈正多面体结构，直径约为50 nm，无尾部结构。(3)噬菌体KP168可裂解20株烧伤患者泛耐药肺炎克雷伯菌中的13株，裂解率为65.0%。(4)感染复数为1.000时，噬菌体KP168与宿主菌共同培养4 h后，效价最高，以此为最佳感染复数。(5)噬菌体KP168与宿主菌混合后4 min，已吸附噬菌体百分比最高，以此为最佳吸附时间。(6)一步生长曲线表明噬菌体KP168裂解宿主菌时，潜伏期约10 min，裂解期约40 min。(7)噬菌体KP168在40 ℃、pH值为7.4时，噬菌斑数最多，活性最大。(8)噬菌体KP168基因组是线状双链DNA，长度为40 114 bp；有48个可能编码序列；与Klebsiella phage_vB_Kp1相似度最高；编码序列翻译蛋白对应的已知最相似蛋白中包含23个假设蛋白和25个已知功能蛋白；未见抗性基因和毒力因子基因；获得GeneBank登录号MN585130。(9)以各感染复数共同培养噬菌体KP168与宿主菌48 h后，生物膜抑制率相近，平均约为45%；效价为1×10 9 PFU/mL噬菌体KP168作用于宿主菌已形成的生物膜4 h后，生物膜破坏率最高，达平均42%。 结论:本研究自污水中分离得到1株烧伤患者泛耐药肺炎克雷伯菌噬菌体——噬菌体KP168，该株噬菌体属于无尾科噬菌体，宿主谱宽、吸附时间短、潜伏期短，具有一定的热和酸碱稳定性；其基因组信息明确，不含抗性基因及毒力因子基因；对细菌生物膜的形成有抑制作用，对已形成的细菌生物膜有破坏作用。

[目的]本研究旨在改进生殖男科领域现有的精液处理方法,特别是针对双层密度梯度法中的300×g 20 min处理条件,以提高受精结局.[方法]收集2020年7月和9月以及2022年3月和5月在中山大学附属第六医院生殖医学中心进行辅助生殖助孕的1623例患者的精液标本进行实验.预实验中,比较四种不同的双层密度梯度方法(200×g 10 min、200×g 20 min、300×g 10 min和300×g 20 min)处理后标本的精子DNA碎片率和回收率.然后,筛选出一种最优的方法作为新方法,并与目前在用的旧方法(300×g 20 min双层梯度法)进行对比,检验受精率是否有统计学差异.在新方法的基础上,进一步优化为单层密度梯度法,并与双层密度梯度法进行对比,检验是否存在统计学差异.实验过程中严格控制温度、离心速度和离心时间,同时记录每组样本的数量和处理条件.[结果]在保证足够的精子回收率的基础上,发现四种双层密度梯度法中300×g 10 min的精子DNA碎片率低于300×g 20 min.因此,选择300×g 10 min作为新方法进行试验.结果 表明,新方法300×g 10 min的总受精率、二核体(2pn)受精率均高于300×g 20 min,且差异有统计学意义(P<0.05);300×g 10 min的卵裂率也略高于300×g 20 min,但差异没有统计学意义(P>0.05).单层密度梯度法的总受精率、2pn受精率均高于双层密度梯度法,但差异没有统计学意义(P>0.05);单层密度梯度法的卵裂率高于双层密度梯度法,囊胚形成率低于双层密度梯度法,且差异均有统计学意义(P<0.05).[结论]相对于现有的300×g 20 min双层梯度法,300×g 10 min双层梯度法成功提高了总受精率、2pn受精率、卵裂率,缩短了精液优化处理的时间;而单层密度梯度法虽提高了卵裂率、节约了试剂成本和操作时间,但其囊胚形成率却出现了下降的情况.这些发现为生殖男科领域的精液处理方法提供了有益的指导和启示.

目的 探讨体外长期培养的长白猪BMSCs全基因组DNA甲基化状态,阐明甲基化在调节基因表达上与BMSCs发生转化的关系.方法 抽取3月龄长白猪胫骨近端骨髓,采用密度梯度离心法并根据细胞贴壁特性对BMSCs进行分离、纯化、体外传代培养.细胞恶性转化通过细胞形态、核型分析、双层软琼脂克隆形成实验、血清依赖性实验以及裸鼠成瘤实验进行验证.使用定制的家猪甲基化芯片和Agilent全基因组表达谱芯片,通过生物信息学分析获得第2代和第25代BMSCs全基因组甲基化表达水平和mRNA表达谱,并进行mRNA-甲基化的关联分析,筛选DNA异常甲基化谱,同时对这些基因进行KEGG富集分析.结果 长期培养的BMSCs逐渐表现出转化细胞的特性:由较大的纺锤形逐渐变为小的梭形,血清依赖程度显著降低,在双层软琼脂培养基中锚着独立生长并形成细胞集落,在裸鼠体内形成肿瘤组织.全基因表达谱芯片筛选出转化过程中上调表达的257条基因和下调表达的315条基因,信号通路分析发现部分细胞周期相关基因表达上调,部分细胞外基质受体相互作用(ECM-receptor interaction)、黏着斑通路(focal adhesion)、肌动蛋白细胞骨架调节(regulation of actin cytoskeleton)、癌症通路(pathways in cancer)、P53等通路相关基因表达下调.DNA甲基化芯片分析得到受甲基化调控的962条差异基因和1 219条受去甲基化的基因,并发现这些基因主要参与细胞代谢、增殖分化、细胞结构、炎性免疫、肿瘤发生等生物过程.联合分析BMSCs转化过程受甲基化调控的基因,发现35个基因的甲基化改变与表达变化方向相反(相关系数r=-0.686,P=0.000),其中21个基因启动子区甲基化程度升高而基因表达下降,14个基因启动子区甲基化程度下降而基因表达升高;同时KEGG富集分析发现多个受甲基化调控、参与干细胞分化的基因及参与的多个细胞信号通路,其中在14条甲基化下调而表达上调的基因中,很多具有调节肿瘤发生与免疫炎性相互平衡的作用,其中CDKN3启动子区甲基化状态改变可能与细胞肿瘤化密切相关.结论 研究结果表明甲基化参与猪BMSCs自发转化,这为BMSCs临床应用预警和防止转化提供了新线索.

目的 探讨中性粒细胞(PMN)与血管内皮细胞(VEC)的交互作用在重叠综合征所致血管内皮损伤中所起的作用以及与细胞间黏附分子(ICAM)-1的作用机制.方法 每次取样均抽取16例健康志愿者空腹外周静脉血,每人2.5 mL,每次取样共40 mL,先后共进行10次取样.使用双层密度梯度离心法分离出PMN,将PMN与VEC直接共培养的实验组与单纯VEC培养的对照组同时置于细胞培养箱内培养4 h,应用天津医科大学总医院呼吸与危重症学科呼吸仿真系统进行间歇伴持续低氧暴露8 h,暴露后分别收集上清液和VEC.分别检测上清液中白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、ICAM-1、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)浓度;qRT-PCR检测VEC促凋亡基因Bak和抑凋亡基因Bcl-xl mRNA表达水平.结果 实验组IL-6、TNF-α、ICAM-1及MDA的浓度均高于对照组,而CAT的活力值低于对照组(P<0.05).实验组BAK mRNA、Bcl-xl mRNA表达水平均高于对照组,而Bcl-xl/Bak低于对照组(P<0.05).实验组ICAM-1与IL-6、TNF-α、MDA呈较强的正相关,而与CAT、Bcl-xl/Bak呈较强的负相关(P<0.05).结论 PMN与VEC的交互作用使重叠综合征所致血管内皮损伤更严重,且ICAM-1在其中起了重要作用.

目的 评价单层和双层密度梯度离心法处理男性不育症患者精液并行宫腔内人工授精(artificial insemination with husband′s sperm,AIH-IUI)的应用效果.方法 连续收集在本中心施行IUI手术的男方精液标本500份,随机采用70％单层法(正常精子45份、轻度少精子症90份、轻度弱精子症90份)或90％+45％双层法(正常精子55份、轻度少精子症110份、轻度弱精子症110份)进行密度梯度离心,优选前后均进行精子质量和功能检测,并随访妊娠结局.结果 经单层法优选后,正常精子组前向运动精子百分率(PR)和PR精子回收率低于双层法,轻度少精子症组精子总活力[PR+非前向运动镜子百分率(NP)]和PR+NP精子回收率高于双层法(均P<0.05);轻度弱精子症组经两种方法优选后,PR和PR+NP精子回收率高于正常精子组和轻度少精子症组(P<0.05);3组精液经两种方法优选后,正常形态精子百分率、诱发顶体反应(AR)率、DNA碎片化指数(DFI)、精子成熟度和精液白细胞浓度与处理前差异均有统计学意义(P<0.05);研究时间段内采用来曲唑(LE)促排方案的334个周期临床妊娠率,单层法68周期,正常精子15.38％,轻度少精子症14.81％,轻度弱精子症17.86％;双层法266周期,正常精子13.21％,轻度少精子症14.15％,轻度弱精子症15.89％(均P>0.05).结论 单层和双层密度梯度离心法均能筛选较高质量的精子,应根据不同病因患者的精液情况选用合适的优选方法.

目的 从医院污水中分离到一株金黄色葡萄球菌噬菌体vB_SauH_IME522,对其进行分离鉴定、测序及进化和基因组学的分析.方法 以一株从临床分离到的多重耐药的金黄色葡萄球菌为宿主菌分离噬菌体,应用双层琼脂平板法进行噬菌体最佳感染复数(optimal MOI)、一步生长曲线(onestep growth curve)实验,使用蔗糖密度梯度离心纯化病毒,并通过透射电镜观察噬菌体形态;应用SDS/蛋白酶裂解方案提取噬菌体全基因组,使用Illumina Miseq测序平台进行噬菌体全基因组测序,测序后对噬菌体全基因组序列进行组装、注释、进化和比较基因组学分析.结果 分离到一株金黄色葡萄球菌噬菌体,命名为vB_SauH_IME522;其最佳感染复数为0.01,一步生长曲线结果显示,其感染宿主菌的潜伏期约为20 min,裂解期约为200 min,平均裂解量89 PFU/cell;电镜观察该噬菌体,噬菌体vB_SauH_IME522具有典型的二十面体结构和收缩的尾部,其头部直径为(70±1)nm,尾部长度为(135±2) nm.基因组测序结果表明,噬菌体基因组全长为140 246 bp,G+C含量为30.2％.基因组注释显示噬菌体vB_SauH_IME522含有223个蛋白编码基因、164个启动子、66个终止子、4个tRNAs及7个耐药相关位点.其中52个基因的编码产物有预测的功能,其余基因的编码产物均为功能未知的推定蛋白.系统发生分析表明,该噬菌体属于Twortvirinae亚科的Kayvirus属.结论 烈性噬菌体vB_SauH_IME522为Twortvirinae亚科的新成员,具有较强的裂解能力和短的潜伏期.

[背景]噬藻体是一类特异性侵染蓝藻的病毒,广泛存在于淡水和海水水体中,参与调控宿主蓝藻的丰度和种群密度,被认为是潜在的蓝藻水华生物防控工具.但目前的研究多集中于海洋噬藻体,对淡水噬藻体的生物学特性和结构生物学等研究较少.[目的]分离更多种类的淡水噬藻体,为研究淡水噬藻体的三维结构、侵染机制、与宿主的共进化关系,及其在蓝藻水华防治中的应用提供理论基础.[方法]采集中国科学技术大学西校区内景观湖也西湖水华暴发水域的水样,利用液体培养基和双层固体平板法对17种宿主蓝藻进行筛选,通过NaCl-PEG沉淀法和氯化铯密度梯度离心分离和纯化噬藻体,并利用负染电镜观察噬藻体的形态,同时采用梯度稀释法测定裂解液的效价.[结果]发现也西湖的水样可特异性侵染本实验室分离自巢湖的一株拟鱼腥藻Pan.侵染后的裂解液中存在4株形态各异的噬藻体,包括1株短尾噬藻体和3株长尾噬藻体,其中包括首次发现的1株含有非典型长轴状头部结构的淡水噬藻体.[结论]也西湖作为巢湖流域的一个小型水体,具有与巢湖类似的水华蓝藻及其噬藻体分布谱,因此可以用于模拟大型湖泊进行相关分子生态学和生物防控的研究.

[背景]与感染细菌和真核生物的病毒相比,目 前发现的古菌病毒数量很少,但是却展现出形态多样性.因此,分离和鉴定新的古菌病毒具有重要意义.[目的]为了进一步了解古菌病毒的多样性,我们从青海省翡翠湖水样中分离到一株新的嗜盐古菌病毒株,研究其生物学特性并进行分类.[方法]首先通过挑取单菌落法分离嗜盐古菌,通过噬菌斑法获得嗜盐古菌病毒,PEG 6000两步沉淀法和CsCl密度梯度离心对病毒颗粒进行浓缩和纯化,用醋酸双氧铀对病毒负染染色,在透射电镜下观察病毒形态,提取病毒基因组后进行测序并进行生物信息学分析,以三氯乙酸法制备病毒蛋白样品并进行SDS-PAGE分析,分别用考马斯亮蓝和苏丹黑B染色并观察其蛋白和脂质条带.[结果]在以Halorubrum属极端嗜盐古菌K2菌株为敏感菌的双层平板上分离到了一株嗜盐古菌病毒,其噬菌斑为浊斑,透射电镜下呈多形性包膜病毒状,直径60 nm左右;含有9 333 bp大小的双链环状DNA基因组,与已报道的p多形包膜病毒属(Betapleolipovirus)的HRPV11、HRPV12和HRPV10具有约75％的一致性,是该属的一个病毒新种.根据形态及基因组特征,将其归属于β多形包膜病毒属,命名为Halorubrumpleomorphicvirus 13(HRPV13).该病毒在50℃以下及pH5.0-9.0具有较好活性,高盐浓度下具有侵染能力,而且病毒侵染宿主后不会造成宿主的大量裂解.[结论]通过电镜观察和生物学特性研究以及基因组测序分析,证实HRPV13为β多形包膜病毒属的新种,其分离和鉴定丰富了多形性病毒种类,这为研究不同区域多形性病毒的进化奠定了基础.

外泌体是由细胞分泌到细胞外的球形脂质双层囊泡,因其含有蛋白质、核酸等物质被认为可以进行细胞间的信号传导,影响细胞代谢.然而,外泌体提取困难、产量较少,限制了该技术在整形外科研究领域进一步研究和发展.目前,已有许多基于外泌体物理及生化特性的分离方法.传统方法包括超速差速离心、密度梯度离心、超滤、尺寸排阻色谱、免疫亲和层析、沉淀法,还有一些新的微流体技术、商业试剂盒.现就外泌体提取技术及其优缺点,对下游分析的影响,以及提高外泌体获得率和纯度的组合提取方法作一综述.

目的 评价密度梯度液配制时间对不连续密度梯度离心法精液优化处理回收率的影响.方法 收集30例患者精液,按实验设计方案制备1.5 mL 40％+1.5 mL80％SpermGrad双层梯度液,分别静置2 h、1 h、30 min、20 min、10 min、5 min后,各管同时加入1 mL同一病人精液进行密度梯度离心精液优化处理,处理后计算各自精液前向的(progressive,PR)精子回收率并统计比较.结果 配制后静置2 h、1 h、30 min、20 min、10 min、5 min精液PR回收率分别为(37.21±3.89)％、(39.62±4.30)％、(43.09±4.11)％、(45.89±4.71)％、(46.65±4.65)％、(46.87±4.84)％.配制20 min、10 min PR回收率与5 min比较无显著差异(P>0.05),配制时间大于20 min各组PR回收率与5 min组比较有显著差异(P<0.05).结论 梯度液配制时间>20 min PR回收率有显著下降,建议梯度液配制后20 min内进行梯度离心以提高PR回收率.