目的:探讨肝细胞生长因子（HGF）修饰的人脂肪间充质干细胞（ADSC）外泌体对糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面的作用及其机制。方法:采用实验研究方法。取2021年2—5月于空军军医大学第一附属医院整形科行腹部手术的3名健康女性（10~25岁）废弃脂肪组织，采用胶原酶消化法获取原代ADSC，培养7 d，用倒置相差显微镜观察细胞形态。取第3代ADSC，转染HGF慢病毒，培养5 d，采用成像系统观察细胞荧光情况并计算转染率。取第3~6代ADSC和第3~6代转染HGF的ADSC，均分别采用密度梯度离心法提取其外泌体，即为ADSC外泌体和HGF-ADSC外泌体。采用透射电子显微镜观察外泌体微观形态，采用流式细胞仪检测外泌体的CD9、CD63、CD81阳性表达。取24只6周龄雄性昆明小鼠，制作糖尿病模型后，在其背部制作全层皮肤缺损创面。按照随机数字表法将小鼠分为磷酸盐缓冲液（PBS）组、单纯HGF组、单纯ADSC外泌体组和HGF-ADSC外泌体组，每组6只，分别作相应处理。伤后3、7、10、14 d，观察创面愈合情况并计算其愈合率，使用多普勒血流仪检测创基血流强度并计算伤后10 d创基相对血流强度百分比。伤后10 d，采用免疫荧光法检测创面中Ki67阳性细胞数，采用免疫组织化学法检测创面中CD31阳性染色且成管样结构的新生血管数，采用蛋白质印迹法检测创面中内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、磷酸化PI3K（p-PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）的蛋白表达并计算p-PI3K与PI3K比值及p-Akt与Akt比值。伤后14 d，采用苏木精-伊红染色法、Masson染色法分别检测创面皮肤组织缺损长度及胶原新生情况，并计算胶原容积分数（CVF）。样本数均为3。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析及Tukey检验。结果:原代ADSC培养7 d，细胞呈梭形，生长密集后呈旋涡状排列。培养5 d后，第3代转染HGF的ADSC携带绿色荧光，转染率为85%。ADSC外泌体及HGF-ADSC外泌体微观形态相似，均呈囊泡状结构，平均粒径分别为103、98 nm，均呈CD9、CD63、CD81阳性。伤后3 d，4组小鼠创面的创周均红肿且有少量渗液；伤后7 d，HGF-ADSC外泌体组创面逐渐缩小，其余3组创面缩小不明显；伤后10 d，4组创面均缩小、结痂；伤后14 d，HGF-ADSC外泌体组创面基本愈合，其余3组均有残余创面。伤后3 d，4组创面愈合率接近（ P>0.05）；伤后7、10 d，HGF-ADSC外泌体组创面愈合率均分别明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（ q值分别为13.11、13.11、11.89，12.85、11.28、7.74， P<0.01）；伤后14 d，HGF-ADSC外泌体组创面愈合率明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（ q值分别为15.50、11.64、6.36， P值均<0.01）。伤后3 d，4组小鼠创基均无明显血运；伤后7 d，HGF-ADSC外泌体组创基开始有微血管形成，其余3组创基仅创缘充血；伤后10 d，除PBS组创基仍无明显血运外，其余3组均有微血管形成；伤后14 d，HGF-ADSC外泌体组创基血流信号强于其余3组且分布均匀。伤后10 d，HGF-ADSC外泌体组创基相对血流强度百分比明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（ q值分别为23.73、19.32、9.48， P值均<0.01）；HGF-ADSC外泌体组创面中Ki67阳性细胞数及新生血管数均明显多于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（ q值分别为19.58、18.20、11.04，20.68、13.79、8.12， P<0.01）。伤后10 d，HGF-ADSC外泌体组创面中eNOS蛋白表达水平明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（ q值分别为53.23、42.54、26.54， P值均<0.01）；HGF-ADSC外泌体组创面中p-PI3K与PI3K的比值及p-Akt与Akt的比值均分别明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（ q值分别为16.11、11.78、6.08，65.54、31.63、37.86， P<0.01）。伤后14 d，HGF-ADSC外泌体组创面皮肤中组织缺损长度明显短于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（ q值分别为20.51、18.50、11.99， P值均<0.01）；HGF-ADSC外泌体组创面中CVF明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（ q值分别为31.31、28.52、12.35， P值均<0.01）。 结论:人HGF-ADSC外泌体可增加创基组织新生血管形成，从而显著促进糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面愈合，其机制可能与HGF-ADSC外泌体通过激活PI3K/Akt信号通路从而促进创面中eNOS的表达增高有关。

目的:分离可裂解烧伤患者泛耐药肺炎克雷伯菌的噬菌体，研究其生物学特性、基因组信息及对细菌生物膜的作用。方法:(1)2018年，取分离自上海交通大学医学院附属瑞金医院(下称瑞金医院)烧伤患者血液的泛耐药肺炎克雷伯菌UA168(下称宿主菌)液，采用污水共培养法及滴板法和双层琼脂平板法，从瑞金医院污水中分离纯化得到烧伤患者泛耐药肺炎克雷伯菌噬菌体，将其命名为噬菌体KP168，观察其噬菌斑形态。(2)取噬菌体KP168液行氯化铯密度梯度离心和透析后，采用磷钨酸负染法通过透射电子显微镜观察噬菌体KP168形态。(3)取噬菌体KP168液，采用滴板法检测其对从瑞金医院烧伤患者血液中分离得到的20株泛耐药肺炎克雷伯菌的裂解能力，计算裂解率。(4)分别以感染复数为10.000、1.000、0.100、0.010和0.001共同常规振荡培养初始效价为9.3×10 11噬菌斑形成单位(PFU)/mL噬菌体KP168液(每管400 μL)和浓度为1×10 9集落形成单位(CFU)/mL宿主菌液(每管4 mL)4 h(每种感染复数1管)，采用双层琼脂平板法测算噬菌体KP168效价(测算方法下同)以筛选最佳感染复数，实验重复3次。(5)以感染复数为0.005混合浓度为1×10 9 CFU/mL宿主菌液(每管4 mL)和效价调整为5×10 7 PFU/mL噬菌体KP168液(每管400 μL)，分别于混合后0(即刻)、1、2、3、4、5、15、30 min(每个时间点1管)采用双层琼脂平板法计数噬菌斑(计数方法下同)，计算已吸附噬菌体百分比以筛选最佳吸附时间，实验重复3次。(6)以感染复数为0.005混合浓度为1×10 9 CFU/mL宿主菌液(每管300 μL)和效价调整为5×10 8 PFU/mL噬菌体KP168液(每管60 μL)，静置最佳吸附时间后常规振荡培养，分别于培养0(即刻)、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 min测算噬菌体KP168效价，绘制一步生长曲线，实验重复3次。(7)取效价为2.5×10 10 PFU/mL噬菌体KP168液，分别于37、40、50、60、70 ℃静置培养1 h(每个时间点3管，每管1 mL)，计数噬菌斑并绘制热稳定曲线。取效价为3.0×10 10 PFU/mL噬菌体KP168液，分别加入pH值为5.0、6.0、7.0、7.4、8.0、9.0、10.0的SM缓冲液于37 ℃静置培养1 h(每种pH值3管，每管含100 μL噬菌体KP168液、900 μL SM缓冲液)，计数噬菌斑并绘制酸碱稳定曲线。(8)取噬菌体KP168液同实验(2)透析后行DNA抽提与测序，用Prokka对全基因组进行注释以获得噬菌体KP168编码序列，使用Nucleotide BLAST功能进行核酸序列比对以寻找与噬菌体KP168核酸序列相似度最高的已知噬菌体，使用Blastx功能将编码序列翻译成蛋白质后进行功能预测，比对抗性基因数据库和毒力因子数据库。(9)于96孔板中，分别以感染复数为1.000、0.100、0.010和0.001，在浓度为1.5×10 8 CFU/mL(浓度下同)的200 μL宿主菌液中加入初始效价为5.8×10 10 PFU/mL噬菌体KP168液20 μL(每种感染复数3孔)共同培养48 h；将200 μL宿主菌液静置培养48 h后，分别加入效价为1×10 6、1×10 7、1×10 8、1×10 9、1×10 10 PFU/mL的噬菌体KP168液20 μL(每种效价3孔)静置作用4 h。2种实验均以200 μL宿主菌液中加入SM缓冲液20 μL(3孔)为阴性对照，以220 μL LB培养液(3孔)为空白对照，均采用酶标仪测定吸光度值并分别计算生物膜抑制率和生物膜破坏率，实验均重复3次。 结果:(1)成功分离纯化噬菌体KP168，其噬菌斑透亮，呈圆形，直径约1.5 mm。(2)噬菌体KP168呈正多面体结构，直径约为50 nm，无尾部结构。(3)噬菌体KP168可裂解20株烧伤患者泛耐药肺炎克雷伯菌中的13株，裂解率为65.0%。(4)感染复数为1.000时，噬菌体KP168与宿主菌共同培养4 h后，效价最高，以此为最佳感染复数。(5)噬菌体KP168与宿主菌混合后4 min，已吸附噬菌体百分比最高，以此为最佳吸附时间。(6)一步生长曲线表明噬菌体KP168裂解宿主菌时，潜伏期约10 min，裂解期约40 min。(7)噬菌体KP168在40 ℃、pH值为7.4时，噬菌斑数最多，活性最大。(8)噬菌体KP168基因组是线状双链DNA，长度为40 114 bp；有48个可能编码序列；与Klebsiella phage_vB_Kp1相似度最高；编码序列翻译蛋白对应的已知最相似蛋白中包含23个假设蛋白和25个已知功能蛋白；未见抗性基因和毒力因子基因；获得GeneBank登录号MN585130。(9)以各感染复数共同培养噬菌体KP168与宿主菌48 h后，生物膜抑制率相近，平均约为45%；效价为1×10 9 PFU/mL噬菌体KP168作用于宿主菌已形成的生物膜4 h后，生物膜破坏率最高，达平均42%。 结论:本研究自污水中分离得到1株烧伤患者泛耐药肺炎克雷伯菌噬菌体——噬菌体KP168，该株噬菌体属于无尾科噬菌体，宿主谱宽、吸附时间短、潜伏期短，具有一定的热和酸碱稳定性；其基因组信息明确，不含抗性基因及毒力因子基因；对细菌生物膜的形成有抑制作用，对已形成的细菌生物膜有破坏作用。

[目的]本研究旨在改进生殖男科领域现有的精液处理方法,特别是针对双层密度梯度法中的300×g 20 min处理条件,以提高受精结局.[方法]收集2020年7月和9月以及2022年3月和5月在中山大学附属第六医院生殖医学中心进行辅助生殖助孕的1623例患者的精液标本进行实验.预实验中,比较四种不同的双层密度梯度方法(200×g 10 min、200×g 20 min、300×g 10 min和300×g 20 min)处理后标本的精子DNA碎片率和回收率.然后,筛选出一种最优的方法作为新方法,并与目前在用的旧方法(300×g 20 min双层梯度法)进行对比,检验受精率是否有统计学差异.在新方法的基础上,进一步优化为单层密度梯度法,并与双层密度梯度法进行对比,检验是否存在统计学差异.实验过程中严格控制温度、离心速度和离心时间,同时记录每组样本的数量和处理条件.[结果]在保证足够的精子回收率的基础上,发现四种双层密度梯度法中300×g 10 min的精子DNA碎片率低于300×g 20 min.因此,选择300×g 10 min作为新方法进行试验.结果 表明,新方法300×g 10 min的总受精率、二核体(2pn)受精率均高于300×g 20 min,且差异有统计学意义(P<0.05);300×g 10 min的卵裂率也略高于300×g 20 min,但差异没有统计学意义(P>0.05).单层密度梯度法的总受精率、2pn受精率均高于双层密度梯度法,但差异没有统计学意义(P>0.05);单层密度梯度法的卵裂率高于双层密度梯度法,囊胚形成率低于双层密度梯度法,且差异均有统计学意义(P<0.05).[结论]相对于现有的300×g 20 min双层梯度法,300×g 10 min双层梯度法成功提高了总受精率、2pn受精率、卵裂率,缩短了精液优化处理的时间;而单层密度梯度法虽提高了卵裂率、节约了试剂成本和操作时间,但其囊胚形成率却出现了下降的情况.这些发现为生殖男科领域的精液处理方法提供了有益的指导和启示.

目的 探讨西维来司他钠对急性Stanford A型主动脉夹层(ATAAD)患者术后谵妄(POD)的预防作用及其机制.方法 纳入急诊行ATAAD手术患者80例,跟据随机数字表法分为西维来司他钠组及对照组各40例.西维来司他钠组于手术麻醉诱导前10 min静脉泵注西维来司他钠直至手术结束,对照组以相同的速率静脉泵注相同体积的生理盐水直至手术结束.术后3 d内采用3 min谵妄诊断量表(3D-CAM)对患者POD发生情况进行评估;于术后24 h时采集患者外周静脉血,采用改良的Ficoll密度梯度离心法提取外周血单个核细胞(PBMCs),比色法检测PBMCs内铁离子(Fe2+)浓度、丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性,Western blotting法检测PBMCs内长链脂酰辅酶A合成酶(ACSL4)及谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)蛋白.记录围手术期情况及不良反应发生情况.结果 西维来司他钠组POD发生率低于对照组(P<0.05),两组POD严重程度评分及POD持续时间比较差异均无统计学意义.西维来司他钠组PBMCs内Fe2+浓度及MDA含量低于对照组,SOD活性高于对照组(P均<0.05).西维来司他钠组PBMCs内ACSL4蛋白表达低于对照组,GPX4蛋白表达高于对照组(P均<0.05).西维来司他钠组ICU入住时间及术后住院时间少于对照组(P均<0.05);两组不良反应发生率差异均无统计学意义.结论 西维来司他钠可预防急性ATAAD手术患者POD的发生,其机制可能与抑制铁死亡从而减轻神经损伤有关.

高大树木木质部水分运输阻力和叶片蒸腾速率随树高的增加导致高度梯度水分供需矛盾.量化分析相关功能性状随高度的变异与性状协同关系,有助于深入理解植物的水分供需机制.该研究选取了生长在湿生同质园中的落羽杉(Taxodium distichum)及其变种池杉(T.distichum var.imbricatum),采用回归分析、单因素方差分析、通径分析等方法探究其水力(枝比导率(Ks)、叶比导率(K1)、导水率损失50％时的水势(P50)、最大蒸腾速率(Tr)、正午叶水势(ΨMD)、胡伯尔值(Hv)等)、光合(最大净光合速率(Pn))和碳经济性状(比叶质量(LMA)、木质部密度(WD))随高度的变异规律、协同关系以及种间性状差异.结果发现:(1)落羽杉和池杉K1、Hv、Pn和LMA随高度增加,其中Pn的增加可能与中冠层的Tr和最大气孔导度(Gs)下降有关.(2)种内性状间协同关系:落羽杉和池杉Ks与Hv显著负相关,落羽杉WD与Ks显著正相关,池杉WD与Hv极显著负相关.(3)落羽杉和池杉高冠层存在水分限制,由达西定律和Tr计算的理论水分供需比(r)量化了水分供需能力的下降,且它们r=0时的理论最大高度(落羽杉:32 m(95％置信区间上限:57 m);池杉:21 m(95％置信区间上限:27 m))在历史记载的最大高度范围内.(4)池杉各个冠层高度K1、Hv和LMA显著高于落羽杉,而Pn、Tr和Gs显著更低;池杉中、高冠层水力安全边界(HSM)显著更高,P50显著更低:池杉保守的水力策略与低资源获取能力导致其最大理论高度较低,而落羽杉激进的水力策略与高资源获取能力导致其最大理论高度较高.

目的 建立护肝布祖热颗粒中各药材的薄层色谱(thin layer chromatography,TLC)鉴别和主要成分的高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)含量测定方法,完善其质量标准,以加强制剂质量的可控性.方法 用TLC法分别对制剂中菊苣根和菊苣子中的秦皮乙素、小茴香和茴香根皮中的东莨菪素、芹菜根和芹菜子中的芹菜素以及菟丝子中的金丝桃苷进行鉴别.建立HPLC法测定护肝布祖热颗粒中秦皮乙素的含量.用SunFire C18 色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为甲醇(A)-1 mL?L-1 磷酸溶液(B),梯度洗脱:0～2 min,5%A;2～5 min,5%～27%A;5～30 min,27%A.柱温为30℃;流速为 1 mL?min-1;进样体积为 10 μL;检测波长为 349 nm.结果 护肝布祖热颗粒中秦皮乙素、东莨菪素、芹菜素和金丝桃苷经TLC鉴别,斑点清晰,分离度较好,缺方阴性对照无干扰;秦皮乙素在 0.16～4.00 μg?mL-1 范围内线性关系良好(r2= 0.9997,n=6),精密度、重复性、稳定性、加样回收率的RSD值均小于2.00%,该批次护肝布祖热颗粒中秦皮乙素的平均含量为2.66 μg?g-1,RSD值为 0.79%.结论 建立的定性鉴别和含量测定方法操作简单,重复性好,可用于护肝布祖热颗粒的质量控制.

目的:建立有效分离、提纯及培养人卵丘颗粒细胞的方法,并与人壁层颗粒细胞的体外培养相比较.方法:收集卵胞浆内单精子显微注射取卵时的卵泡液和直接机械分离卵母细胞所得的卵丘颗粒细胞复合物,直接将卵丘颗粒细胞复合物接种于培养皿中培养.用密度梯度离心法分离卵泡液中的人壁层颗粒细胞.用免疫荧光法检测卵泡刺激素受体(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)的表达;用CCK-8法检测细胞生长曲线;用ELISA检测这2种颗粒细胞分泌雌激素的能力.结果:直接法所得人卵丘颗粒细胞培养24 h后可贴壁,体外培养生长状态与人壁层颗粒细胞相似;免疫荧光检测显示两者均表达FSHR;CCK-8实验结果表明,两者体外培养生长曲线相似;ELISA结果显示两者分泌雌激素能力相当.结论:利用机械切割获得人卵子周围卵丘颗粒细胞复合物直接培养的方法操作简单,获得的人卵丘颗粒细胞具有与人壁层颗粒细胞相似的生长状态、生长曲线以及雌激素分泌能力,可作为人颗粒细胞亚群体外培养方法的补充.

目的 通过原核系统表达纯化嵌合肠道病毒71型(EV71)中和表位SP70的病毒样颗粒(VLPs),作为备选的EV71基因重组亚单位疫苗.方法 将SP70插入乙肝病毒核心抗原(HBcAg)截短序列的主要免疫显性区域,合成融合蛋白基因后连接表达质粒转化入大肠埃希菌诱导表达,经DEAE离子交换层析、CsCl垫层离心以及密度梯度离心后得到纯化的重组VLPs,并通过Western Blot和ELISA实验鉴定其抗原性.结果 成功构建重组质粒pHBc-SP70,在大肠埃希菌中经IPTG低温诱导后高效表达,可溶性目的蛋白经离子交换层析、CsCl垫层离心和密度梯度离心三步纯化后纯度可达90％以上;纯化的融合蛋白可自发折叠组装为病毒样空心颗粒,与抗SP70单克隆抗体和抗HBc单克隆抗体均可特异性结合.结论 在原核系统中成功高效表达和纯化了表面展示EV71中和表位的嵌合HBc-SP70 VLPs,并证实其具有良好的抗原性,为该EV71基因重组疫苗的免疫效果评价奠定了基础.

目的:建立一种纯度较高的原代大鼠脑微血管内皮细胞的分离培养方法.方法:取7～10日龄SD大鼠脑组织,经匀浆,牛血清白蛋白密度梯度离心,Ⅱ型胶原酶消化获得脑微血管段后,置于CO2培养箱中进行原代培养.通过细胞形态学观察、第Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色鉴定所培养的细胞.结果:在倒置显微镜下,体外培养24～48 h后,细胞从贴壁的脑微血管段周围爬出,单个细胞为短梭形或多角形,呈团簇状单层贴壁生长,待细胞密集融合后,则成典型的“铺路石样”涡旋状排列;Ⅷ因子免疫细胞化学染色检测,相关抗原表达为阳性,细胞胞质显棕黄色,阳性细胞率达99％以上.结论:该方法能够成功分离培养出原代大鼠脑微血管内皮细胞.

目的:拟建立基于小鼠放射性肺损伤影像学改变的三维生物学有效剂量(BED)预测模型.方法:对研究纳入单次与分次照射的实验结果进行BED与数学建模.采用8～10周龄C57BL6雌性小鼠随机分组进行X线全肺野照射,分别给予单次照射组0.0、10.5、12.5、14.5、17.5、20.0 Gy梯度剂量照射;分割照射组单次0.0、2.0、4.0、6.0、7.0、8.5 Gy,共5次分割照射.照射后24周行CT扫描成像、经三维分割算法获得肺部平均密度与肺部体积值.结果:根据BED分别建立基于CT肺密度、肺体积的剂量-效应关系,其中位剂量(半数有效剂量)分别为(68.17±10.53)Gy(adjusted R2=0.89)、(84.12±19.70)Gy(adjusted R2=0.94).进一步对CT肺密度与肺体积进行线性回归分析后发现两者存在显著线性相关性(R2=0.96,P<0.0001).根据这一重要动态关联,最终建立了BED剂量与肺纤维化基于双影像学参数的三维剂量-效应评估模型.结论:首次提出了辐射诱导小鼠肺纤维化的三维BED模型.该模型可以对不同分割剂量组的纤维化程度进行准确地分层与预测,为开展部分肺野照射、抗肺纤维化新药测试等研究奠定放射生物学基础.