为进一步提高口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)疫苗的免疫效果,本研究采用仿生矿化方法,将 Zn2+和 2-甲基咪唑按照不同浓度配比制备了不同粒径的FMDV VLPs-沸石咪唑骨架-8(zeolitic imidazolate framework-8,ZIF-8)复合物,以探究尺寸效应对免疫效果的影响.结果显示,成功制备出 3 种不同粒径的 FMDV VLPs-ZIF-8,粒径分别约为 70、100、1 000 nm.细胞毒性和组织病理学试验表明,3 种复合物均具有良好的生物安全性.小鼠免疫试验表明,3 种复合物均能明显提高中和抗体和特异性抗体水平,并且随着复合物体积的减小,其免疫效果也随之增强.本研究表明,ZIF-8 包封 FMDV VLPs可显著增强其免疫效果,且具有尺寸依赖性.

瞬时表达是目前利用哺乳动物细胞表达口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)衣壳蛋白的主流方法.为实现染色体稳定表达 FMDV 衣壳蛋白并高效组装出病毒样颗粒(virus like particles,VLPs),本研究构建了piggyBac(PB)转座-组成型表达、PB转座-四环素(tetracycline,Tet)诱导型表达两套质粒.利用荧光蛋白标记技术,验证了质粒的功能.通过抗生素筛选得到了组成型表达P12A3C(WT/L127P)基因的BHK-21 细胞池(C-WT、C-L127P)和诱导型表达P12A3C(WT/L127P)基因的BHK-21 细胞池(I-WT、I-L127P).荧光观察和PCR检测证明了绿色荧光蛋白、3C蛋白酶、反向四环素转录激活因子等基因的稳定整合.Western blotting、酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)实验证明了细胞池I-L127P具有更强的衣壳蛋白和VLPs生产能力.本研究首次实现了哺乳动物细胞染色体诱导表达 FMDV 衣壳蛋白,有助于推动哺乳动物生产 FMDV VLPs疫苗的技术工艺,也为构建其他蛋白的哺乳动物细胞诱导型表达系统提供了参考.

目的 本实验旨在表达出高可溶性的A型口蹄疫病毒1D蛋白,并通过电子显微镜检测,以期望形成纳米样颗粒.方法 根据A型口蹄疫病毒核酸序列,得到FMDV A/GDMM/CHA/2013株的1D蛋白基因,并进行截短和优化,共132个氨基酸;同时,从结肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)中分离得到135个氨基酸的铁蛋白(Fn)基因片段,将A型口蹄疫病毒1D蛋白与铁蛋白串联,设计并合成了口蹄疫病毒1D蛋白-铁蛋白片段,命名为CcFnt166AS.构建了CcFnt166AS融合Grifin、GST、MBP、Sumo、Thioredoxin、γ-crystallin、ArsC、PpiB、CeHSP17等9种不同可溶性标签的表达重组载体.分别转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,SDS-PAGE电泳对融合蛋白的可溶性表达进行检测,筛选出高可溶性表达的CcFnt166AS融合蛋白.重组蛋白通过Ni-NTA Agarose亲和纯化,进行电子显微镜检测.结果 成功构建9种CcFnt166AS表达载体;9个标签中,MBP与CcFnt166AS蛋白相融合的可溶表达效果最好,并获得了高纯度的MBP-CcFnt166AS重组蛋白质;电子显微镜结果显示,MBP-CcFnt166AS形成了纳米样颗粒.结论 本实验建立了稳定获得CcFnt166AS重组蛋白质的方法.

目的 本实验旨在高效表达可溶性的O型口蹄疫病毒VP1蛋白,并形成纳米样颗粒.方法 根据O型口蹄疫病毒核酸序列,得到FMDV O/MYA/7/98株的VP1蛋白基因,并进行截短和优化,共73个氨基酸;同时,从肠道沙门菌(Salmonella enterica)中分离得到135个氨基酸铁蛋白(Fn)基因片段,将O型口蹄疫病毒VP1蛋白与铁蛋白串联,设计并合成了口蹄疫病毒VP1蛋白-铁蛋白基因片段,命名为SeFnt16798.构建了SeFnt16798融合Grifin、GST、MBP、Sumo、Thioredoxin、γ-crystallin、ArsC、PpiB、CeHSP17等9种不同可溶性标签的表达重组载体.分别转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,SDS-PAGE电泳对融合蛋白的可溶性表达进行检测,筛选高效可溶性表达的SeFnt16798融合蛋白.重组蛋白通过Ni-NTA Agarose亲和纯化,进行电子显微镜检测.结果 实验成功构建9个SeFnt16798表达载体;9个标签中,MBP与SeFnt16798蛋白相融合的可溶性表达效果最好,并获得了高纯度的MBP-SeFnt16798重组蛋白质;电子显微镜结果显示,MBP-SeFnt16798形成了纳米样颗粒.结论 本实验建立了稳定获得SeFnt16798重组蛋白质的方法.

目的 建立O型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)血清抗体的竞争ELISA检测方法,并进行验证.方法 采用O型FMDV病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)作为包被抗原,建立用于检测FMDV血清抗体的竞争ELISA方法.对方法的抗原包被浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 μg/mL)、抗原包被温度及时间(4℃过夜、37℃ 1 h、37℃1.5 h、37℃2h、37℃2.5h、37℃3h)、血清稀释度(1∶2、1∶4、1∶8、1∶16稀释)、HRP-IgG稀释度(1∶10 000～1∶20000稀释)、封闭液种类(不封闭、1％ BSA封闭、2％ BSA封闭、5％脱脂乳封闭)、封闭液作用时间(30、60、90、120 min)、血清与HRP-IgG作用时间(30、60、90、120、150 min)、底物TMB作用时间(1O、15、20、25、30 min)进行优化.同时验证方法的交叉反应、特异性及敏感性、精密性.采用建立的方法及O型FMDV抗体液相阻断ELISA检测试剂盒分别检测未知血清背景的138份猪和牛血清,计算两者的符合率.结果 方法最适检测条件为:抗原包被浓度0.5 μg/mL,抗原包被温度及时间为4℃过夜,血清稀释度为1:4;HRP-IgG稀释度为1:18 000;封闭液为1％ BSA,封闭液作用时间为30 min;HRP-IgG与血清作用时间为30 min;底物作用时间为10 min.21份不同猪病的阳性血清中,除3份O型FMD阳性血清为阳性外,其他血清样品为阴性,该方法无交叉反应;敏感性为90.4％,特异性为95.7％;批内和批间精密性试验变异系数(CV)均＜10％.该方法与口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒检测结果的符合率为97％.结论 建立的方法具有良好的特异性及精密性,且操作简便,可用于O型FMDV血清抗体的检测.

为提高口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)的特异性识别和递呈,为靶向疫苗研究奠定基础,利用反向PCR技术,将卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)第257-264位氨基酸(Amino acids,aa)的短肽嵌入FMDV结构蛋白VP3第171-172位aa或第173-174位aa,通过大肠杆菌表达FMDV结构蛋白VP0、VP1和嵌合型VP3,体外组装得到嵌合OVA257.264肽的病毒样颗粒(VLPOVA).用动态光散射、透射电镜检测VLPOVA大小和形态,免疫印迹、酶联免疫吸附试验和激光共聚焦显微镜检测短肽的嵌入情况.结果 显示在VP3的第173-174位aa嵌入OVA,不影响蛋白表达和VLPs的组装且OVA位于VLPOVA的表面,VLPOVA粒径比VLPs稍大.

选取能够与口蹄疫病毒结构蛋白相互作用且有特殊结构的核酸片段5'非翻译区(5'UTR)和内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site,IRES)作为支架,进行病毒样颗粒组装的研究.通过对组装产物进行粒径、表面电位、凝胶阻滞、核酸酶消化、尺寸排阻色谱、透射电镜、圆二色光谱等检测,结果表明,核酸片段5'UTR和IRES能与口蹄疫病毒样颗粒共组装并形成病毒样颗粒.通过统计学分析发现VLPs-5'UTR的75S颗粒的组装效率显著高于单纯VLPs组(P＜0.001)和VLPs-IRES (P＜0.01),而VLPs-IRES的12S颗粒的组装效率显著高于单纯VLPs组(P＜0.000 1)和VLPs-5'UTR (P＜0.000 1),表明口蹄疫病毒自身核酸片段5'UTR更有利于口蹄疫病毒样颗粒的组装.该研究对促进口蹄疫病毒样颗粒组装提出了新的思路和优化策略,有助于病毒样颗粒疫苗的研发.

口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由 口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一种烈性传染病,主要感染牛、猪、绵羊、山羊等偶蹄动物,我国将其列为一类传染病,注射疫苗是控制该疾病的有效措施.病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)的形态结构与天然病毒高度相似,且不含病毒核酸,具有与完整病毒粒子相似的免疫原性,可有效诱导机体产生免疫应答,许多抗原可通过基因工程的方法在VLPs表面展示.FMDV的衣壳蛋白可自组装成VLPs,是一种理想的疫苗.本文主要对FMDV VLPs及其表达系统的研究进展作一综述.

病毒样颗粒(Virus like particles,VLPs)的稳定性是目前影响口蹄疫VLPs疫苗质量的主要因素.为进一步提升口蹄疫VLPs疫苗的质量,基于口蹄疫病毒三维空间结构,通过动力学分析软件设计并筛选出3个氨基酸改造位点.经点突变试剂盒成功制备出上述3种突变型重组质粒,转化大肠杆菌Escherichia coli BL21菌株后经体外诱导表达,Ni离子层析柱纯化后,SDS-PAGE结果证明3种氨基酸突变不影响目标蛋白的表达.体外组装获得的3种突变型VLPs稳定性研究结果发现,内部疏水性侧链氨基酸的引入使VLPs的形态变得更加均一(N4017W),且其稳定性比其他两种VLPs明显提高.结果表明,衣壳内部疏水性作用力有助于VLPs的形成且有助于维持衣壳的稳定性,为提高VLPs疫苗质量提供了新的研究思路,有助于推进VLPs疫苗的发展.