19世纪末，口蹄疫在欧洲迅速蔓延。1897年，德意志帝国政府派出科学家弗里德里希·勒夫勒和保罗·弗洛施共同研究口蹄疫，发现了口蹄疫病毒。1899年，勒夫勒在格赖夫斯·瓦尔德卫生研究所及城外的一个农场上进行实验研究。由于研究地址存在安全隐患，政府暂停了该研究。勒夫勒等经过3年筹备于1910年10月10日，在德国的里姆斯岛上建立了世界上第一个病毒学研究机构，迄今已有百年历史。这所最早的病毒学研究机构现已成为联邦动物健康研究中心，对人类研究人畜共患疾病具有重大意义。

目前,动物疫苗佐剂主要以铝佐剂和油乳佐剂为主,存在免疫效果差、副作用明显等问题,亟须安全有效的新型佐剂替代.随着纳米颗粒在佐剂应用领域研究的深入,其良好的免疫增强作用、生物相容性、纳米尺寸效应、抗原负载能力、抗原缓释效应和组织靶向性等优势引起了研究人员的极大关注,有望作为新型动物疫苗佐剂用于动物疾病防治.迄今为止,针对如猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪流行性腹泻、非洲猪瘟、牛病毒性腹泻、口蹄疫、禽流感和新城疫等重要动物传染病纳米疫苗的研究取得了重大进展.综述总结了国内外动物疫苗纳米颗粒佐剂的应用及作用机制,分析了影响纳米颗粒佐剂免疫增强效果的理化因素,以期为新型动物疫苗佐剂研制及开发提供参考.

[背景]口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的感染牛、羊和猪等偶蹄动物的主要疫病之一.口蹄疫病毒的结构蛋白VP1 包含多个能够引起机体免疫反应的主要位点,因此 VP1 是研究亚单位疫苗的方向靶标.谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)作为安全生产菌株,是医药用蛋白生产的优势细胞工厂.[目的]利用C.glutamicum作为受体菌株表达外源蛋白的优势实现VP1 的外源表达.[方法]根据VP1 结构蛋白的基因序列、相应功能和C.glutamicum的密码子偏好性设计并合成VP1 基因,与pXMJ19载体连接构成重组质粒pXMJ19-VP1.C.glutamicum CGMCC 1.15647 菌株用于表达VP1-6×his蛋白,并对蛋白表达元件启动子、5′非翻译端(5′UTR)、目的蛋白自身N端等进行优化,同时对培养条件等进一步优化,采用SDS-PAGE和Western blotting技术检测VP1 蛋白的表达情况.最后应用间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定本研究中生产的VP1 的免疫活性.[结果]SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明VP1 蛋白能在C.glutamicum CGMCC 1.15647 菌株成功表达,将Ptac启动子替换为合成型启动子PH36 能提高蛋白产量.在此基础上,通过插入不同的 5′UTR序列和VP1 蛋白N端氨基酸的改变能进一步提高蛋白产量并可利用CspB信号肽实现分泌表达.发酵试验表明,VP1 摇瓶发酵培养最优条件为 30℃、24 h.ELISA试验表明,本研究中的 VP1 可与阳性血清特异性结合.[结论]本研究在谷氨酸棒状杆菌中成功表达 FMDV的VP1蛋白,并通过优化蛋白表达元件的方法进一步提高了产量,为开发新型FMD免疫诊断试剂和安全高效的亚单位疫苗奠定了良好的基础.

为进一步提高口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)疫苗的免疫效果,本研究采用仿生矿化方法,将 Zn2+和 2-甲基咪唑按照不同浓度配比制备了不同粒径的FMDV VLPs-沸石咪唑骨架-8(zeolitic imidazolate framework-8,ZIF-8)复合物,以探究尺寸效应对免疫效果的影响.结果显示,成功制备出 3 种不同粒径的 FMDV VLPs-ZIF-8,粒径分别约为 70、100、1 000 nm.细胞毒性和组织病理学试验表明,3 种复合物均具有良好的生物安全性.小鼠免疫试验表明,3 种复合物均能明显提高中和抗体和特异性抗体水平,并且随着复合物体积的减小,其免疫效果也随之增强.本研究表明,ZIF-8 包封 FMDV VLPs可显著增强其免疫效果,且具有尺寸依赖性.

瞬时表达是目前利用哺乳动物细胞表达口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)衣壳蛋白的主流方法.为实现染色体稳定表达 FMDV 衣壳蛋白并高效组装出病毒样颗粒(virus like particles,VLPs),本研究构建了piggyBac(PB)转座-组成型表达、PB转座-四环素(tetracycline,Tet)诱导型表达两套质粒.利用荧光蛋白标记技术,验证了质粒的功能.通过抗生素筛选得到了组成型表达P12A3C(WT/L127P)基因的BHK-21 细胞池(C-WT、C-L127P)和诱导型表达P12A3C(WT/L127P)基因的BHK-21 细胞池(I-WT、I-L127P).荧光观察和PCR检测证明了绿色荧光蛋白、3C蛋白酶、反向四环素转录激活因子等基因的稳定整合.Western blotting、酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)实验证明了细胞池I-L127P具有更强的衣壳蛋白和VLPs生产能力.本研究首次实现了哺乳动物细胞染色体诱导表达 FMDV 衣壳蛋白,有助于推动哺乳动物生产 FMDV VLPs疫苗的技术工艺,也为构建其他蛋白的哺乳动物细胞诱导型表达系统提供了参考.

目的 本实验旨在表达出高可溶性的A型口蹄疫病毒1D蛋白,并通过电子显微镜检测,以期望形成纳米样颗粒.方法 根据A型口蹄疫病毒核酸序列,得到FMDV A/GDMM/CHA/2013株的1D蛋白基因,并进行截短和优化,共132个氨基酸;同时,从结肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)中分离得到135个氨基酸的铁蛋白(Fn)基因片段,将A型口蹄疫病毒1D蛋白与铁蛋白串联,设计并合成了口蹄疫病毒1D蛋白-铁蛋白片段,命名为CcFnt166AS.构建了CcFnt166AS融合Grifin、GST、MBP、Sumo、Thioredoxin、γ-crystallin、ArsC、PpiB、CeHSP17等9种不同可溶性标签的表达重组载体.分别转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,SDS-PAGE电泳对融合蛋白的可溶性表达进行检测,筛选出高可溶性表达的CcFnt166AS融合蛋白.重组蛋白通过Ni-NTA Agarose亲和纯化,进行电子显微镜检测.结果 成功构建9种CcFnt166AS表达载体;9个标签中,MBP与CcFnt166AS蛋白相融合的可溶表达效果最好,并获得了高纯度的MBP-CcFnt166AS重组蛋白质;电子显微镜结果显示,MBP-CcFnt166AS形成了纳米样颗粒.结论 本实验建立了稳定获得CcFnt166AS重组蛋白质的方法.

塞尼卡谷病毒(Seneca valley virus,SVV)为小RNA病毒科塞尼卡病毒属的唯一成员,2002年首次发现于PER.C6细胞培养物中,被鉴定为细胞培养基中的污染物.最初SVV被用作溶瘤病毒进行肿瘤治疗研究.现已证实SVV感染猪能够引发原发性水泡病,引起猪的鼻吻、蹄部冠状带的水泡病变,同时伴有跛行、厌食、嗜睡和发烧等临床表现.与口蹄疫、猪水泡病和水泡性口炎引起的临床症状难以区分.2015-2017年期间,在美国、中国、泰国等多个国家暴发了SVV疫情,并且流行范围逐步扩大.针对该病的不断扩散,急需提出和制定有效的诊断与防控策略及措施.因此,一些新的诊断方法被不断开发出来,新的防控策略也在逐步建立.本文主要针对SVV最新的流行态势及特点、诊断与防控技术进行综述,旨在提供SVV最新研究进展,提高疾病防控及科研工作人员对该病的进一步认识和了解,为该病的防控提供理论依据和参考.

目的 本实验旨在高效表达可溶性的O型口蹄疫病毒VP1蛋白,并形成纳米样颗粒.方法 根据O型口蹄疫病毒核酸序列,得到FMDV O/MYA/7/98株的VP1蛋白基因,并进行截短和优化,共73个氨基酸;同时,从肠道沙门菌(Salmonella enterica)中分离得到135个氨基酸铁蛋白(Fn)基因片段,将O型口蹄疫病毒VP1蛋白与铁蛋白串联,设计并合成了口蹄疫病毒VP1蛋白-铁蛋白基因片段,命名为SeFnt16798.构建了SeFnt16798融合Grifin、GST、MBP、Sumo、Thioredoxin、γ-crystallin、ArsC、PpiB、CeHSP17等9种不同可溶性标签的表达重组载体.分别转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,SDS-PAGE电泳对融合蛋白的可溶性表达进行检测,筛选高效可溶性表达的SeFnt16798融合蛋白.重组蛋白通过Ni-NTA Agarose亲和纯化,进行电子显微镜检测.结果 实验成功构建9个SeFnt16798表达载体;9个标签中,MBP与SeFnt16798蛋白相融合的可溶性表达效果最好,并获得了高纯度的MBP-SeFnt16798重组蛋白质;电子显微镜结果显示,MBP-SeFnt16798形成了纳米样颗粒.结论 本实验建立了稳定获得SeFnt16798重组蛋白质的方法.

旨在应用体积排阻色谱法测定口蹄疫灭活疫苗中的146S抗原含量.使用TSKgel G4000SWXL (7.8 mm×30 cm)色谱柱,以pH 7.2的缓冲盐体系作为流动相,流速为0.6 mL/min,进样量为100μL,检测波长为259nm.以口蹄疫病毒(O型)灭活146S抗原纯化样品建立标准曲线;使用灭活抗原液配制3份口蹄疫灭活疫苗,并进行精密度、重复性、特异性、耐受性验证;应用该方法快速测定16批疫苗的146S含量.结果表明,抗原浓度在0.56-67.42 μg/mL范围内,其峰面积与浓度的线性关系良好(R2=0.996,n=10),3份疫苗146S抗原测定回收率分别为93.6％ (RSD=2.7％,n=3)、102.3％ (RSD=2.6％,n=3)、95.5％ (RSD=5.1％,n=3),方法重复性好、准确性强(RSD=0.5％,n=6),且操作简便、高效,对16批疫苗的测定结果较理想.应用该方法有望快速高效地检测口蹄疫灭活疫苗的146S抗原含量,为疫苗的质量控制提供有力支持.

目的 研究O型口蹄疫病毒中VP21-33肽段能否增强VP1141-160肽段的免疫原性及其可能的免疫机制.方法 分别构建两种新的含有VP1和VP2的重组质粒(PcDNA3.1-VP1、PcDNA3.1-VP2),并将重组质粒制备成纳米颗粒,检测其体外转染效率.然后将上述纳米颗粒作为基因疫苗免疫Balb/c小鼠,PBS及空载质粒作为对照.液相阻断ELISA方法检测不同时间小鼠血清中抗体情况;流式细胞术和免疫组化染色的方法分析免疫小鼠外周血、脾脏和腹股沟淋巴结中CD4+、CD8+T淋巴细胞的差异;淋巴细胞增殖实验检测免疫28 d后小鼠外周血中淋巴细胞的增殖能力.结果 对重组质粒进行鉴定,结果显示重组质粒(PcDNA3.1-VP1、PcDNA3.1-VP2)构建成功;体外转染实验结果显示该纳米颗粒体外转染效率约为28％,具有较高的转染效率.ELISA检测显示VP1与VP2共同免疫小鼠血清中的抗体滴度均在初次免疫后的第21和28 d达到最高,并显著高于对照组(F=4.625,P<0.05);流式和免疫组化染色结果分析发现VP1与VP2共同免疫小鼠血液、淋巴结和脾脏中CD4+、CD8+T淋巴细胞数均显著高于对照组;淋巴细胞增殖实验结果显示VP1与VP2共同免疫小鼠淋巴细胞增殖能力均显著高于对照组(F=12.73,P<0.05).结论 O型FMDV VP2的1-33肽段能增强VP1的141-160肽段的免疫原性,其可能通过激活细胞免疫和体液免疫实现.