目的 本实验旨在高效表达可溶性的O型口蹄疫病毒VP1蛋白,并形成纳米样颗粒.方法 根据O型口蹄疫病毒核酸序列,得到FMDV O/MYA/7/98株的VP1蛋白基因,并进行截短和优化,共73个氨基酸;同时,从肠道沙门菌(Salmonella enterica)中分离得到135个氨基酸铁蛋白(Fn)基因片段,将O型口蹄疫病毒VP1蛋白与铁蛋白串联,设计并合成了口蹄疫病毒VP1蛋白-铁蛋白基因片段,命名为SeFnt16798.构建了SeFnt16798融合Grifin、GST、MBP、Sumo、Thioredoxin、γ-crystallin、ArsC、PpiB、CeHSP17等9种不同可溶性标签的表达重组载体.分别转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,SDS-PAGE电泳对融合蛋白的可溶性表达进行检测,筛选高效可溶性表达的SeFnt16798融合蛋白.重组蛋白通过Ni-NTA Agarose亲和纯化,进行电子显微镜检测.结果 实验成功构建9个SeFnt16798表达载体;9个标签中,MBP与SeFnt16798蛋白相融合的可溶性表达效果最好,并获得了高纯度的MBP-SeFnt16798重组蛋白质;电子显微镜结果显示,MBP-SeFnt16798形成了纳米样颗粒.结论 本实验建立了稳定获得SeFnt16798重组蛋白质的方法.

旨在应用体积排阻色谱法测定口蹄疫灭活疫苗中的146S抗原含量.使用TSKgel G4000SWXL (7.8 mm×30 cm)色谱柱,以pH 7.2的缓冲盐体系作为流动相,流速为0.6 mL/min,进样量为100μL,检测波长为259nm.以口蹄疫病毒(O型)灭活146S抗原纯化样品建立标准曲线;使用灭活抗原液配制3份口蹄疫灭活疫苗,并进行精密度、重复性、特异性、耐受性验证;应用该方法快速测定16批疫苗的146S含量.结果表明,抗原浓度在0.56-67.42 μg/mL范围内,其峰面积与浓度的线性关系良好(R2=0.996,n=10),3份疫苗146S抗原测定回收率分别为93.6％ (RSD=2.7％,n=3)、102.3％ (RSD=2.6％,n=3)、95.5％ (RSD=5.1％,n=3),方法重复性好、准确性强(RSD=0.5％,n=6),且操作简便、高效,对16批疫苗的测定结果较理想.应用该方法有望快速高效地检测口蹄疫灭活疫苗的146S抗原含量,为疫苗的质量控制提供有力支持.

目的 研究O型口蹄疫病毒中VP21-33肽段能否增强VP1141-160肽段的免疫原性及其可能的免疫机制.方法 分别构建两种新的含有VP1和VP2的重组质粒(PcDNA3.1-VP1、PcDNA3.1-VP2),并将重组质粒制备成纳米颗粒,检测其体外转染效率.然后将上述纳米颗粒作为基因疫苗免疫Balb/c小鼠,PBS及空载质粒作为对照.液相阻断ELISA方法检测不同时间小鼠血清中抗体情况;流式细胞术和免疫组化染色的方法分析免疫小鼠外周血、脾脏和腹股沟淋巴结中CD4+、CD8+T淋巴细胞的差异;淋巴细胞增殖实验检测免疫28 d后小鼠外周血中淋巴细胞的增殖能力.结果 对重组质粒进行鉴定,结果显示重组质粒(PcDNA3.1-VP1、PcDNA3.1-VP2)构建成功;体外转染实验结果显示该纳米颗粒体外转染效率约为28％,具有较高的转染效率.ELISA检测显示VP1与VP2共同免疫小鼠血清中的抗体滴度均在初次免疫后的第21和28 d达到最高,并显著高于对照组(F=4.625,P<0.05);流式和免疫组化染色结果分析发现VP1与VP2共同免疫小鼠血液、淋巴结和脾脏中CD4+、CD8+T淋巴细胞数均显著高于对照组;淋巴细胞增殖实验结果显示VP1与VP2共同免疫小鼠淋巴细胞增殖能力均显著高于对照组(F=12.73,P<0.05).结论 O型FMDV VP2的1-33肽段能增强VP1的141-160肽段的免疫原性,其可能通过激活细胞免疫和体液免疫实现.

为了能更高效和准确地对口蹄疫疫情进行诊断监测,建立了O型口蹄疫病毒抗体高通量液相阻断化学发光免疫定性检测方法(Liquid-phase blocking CLIA,LPB-CLIA).通过以单一稀释倍数稀释样本进行检测,计算抑制率作为检测结果,将检测通量提高了5倍左右.应用受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic,ROC)确定试验最佳临界值为62.5％.重复性实验结果显示方法批内CV小于10％,批间CV小于15％.通过对326份田间血清样本检测结果与LPB-ELISA检测结果对比,敏感性为94.6％,特异性为95.6％,检测准确度为95.1％.建立的LPB-CLIA方法敏感性和特异性良好,缩减了时间和经济成本,为国内口蹄疫的检疫提供了新的方法.

[目的]为了研究O型口蹄疫病毒VP3 G-H环中氨基酸突变对其生物学特性的影响.[方法]借助口蹄疫病毒反向遗传操作技术平台拯救出2株定点突变体rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C.进行蚀斑形成试验、一步生长曲线的绘制、TCID50和LD50的测定、间接免疫荧光与激光共聚焦显微镜检测.[结果]结果显示,与骨架病毒rHN相比,虽然rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C对BHK-21细胞的感染性及其蚀斑表型和复制动力学无显著性差异;但rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C对乳鼠的致病力明显减弱,且均获得了小窝蛋白介导侵染CHO-K1细胞的能力.[结论]VP3上第3 174位特征性氨基酸突变影响O型口蹄疫病毒感染宿主细胞的毒力及其内吞作用路径,这有助于我们认知VP3 G-H环在口蹄疫病毒粒子立体空间构象中潜在的作用.

目的 获得口蹄疫病毒O/Ind2001株VP1蛋白的抗原信息. 方法 采用生物信息学方法预测VP1蛋白二级结构及其T、B淋巴细胞优势抗原表位.从GenBank中获取蛋白基因信息,通过DNAStar生物学软件、SOMPA预测蛋白质的二级结构及其理化性质;通过Phyre的同源建模服务器预测蛋白质三级结构;通过ABCpred、SYFPEITHI、IDBE等工具联合预测蛋白的T、B淋巴细胞的优势抗原表位. 结果 该蛋白由213个氨基酸组成,原子组成为C1048H1674N298O310S4,pI值为9.32,不稳定系数为21.89,亲水系数-0.327,为稳定性亲水蛋白.其二级结构主要成分为无规则卷曲,约占47.42％,预测含有多个T、B淋巴细胞抗原表位. 结论 生物信息学方法预测口蹄疫O型Ind-2001毒株VP1蛋白为稳定性蛋白,含有T、B淋巴细胞抗原表位,可为其表位疫苗的研究提供参考.

目的 建立O型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)血清抗体的竞争ELISA检测方法,并进行验证.方法 采用O型FMDV病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)作为包被抗原,建立用于检测FMDV血清抗体的竞争ELISA方法.对方法的抗原包被浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 μg/mL)、抗原包被温度及时间(4℃过夜、37℃ 1 h、37℃1.5 h、37℃2h、37℃2.5h、37℃3h)、血清稀释度(1∶2、1∶4、1∶8、1∶16稀释)、HRP-IgG稀释度(1∶10 000～1∶20000稀释)、封闭液种类(不封闭、1％ BSA封闭、2％ BSA封闭、5％脱脂乳封闭)、封闭液作用时间(30、60、90、120 min)、血清与HRP-IgG作用时间(30、60、90、120、150 min)、底物TMB作用时间(1O、15、20、25、30 min)进行优化.同时验证方法的交叉反应、特异性及敏感性、精密性.采用建立的方法及O型FMDV抗体液相阻断ELISA检测试剂盒分别检测未知血清背景的138份猪和牛血清,计算两者的符合率.结果 方法最适检测条件为:抗原包被浓度0.5 μg/mL,抗原包被温度及时间为4℃过夜,血清稀释度为1:4;HRP-IgG稀释度为1:18 000;封闭液为1％ BSA,封闭液作用时间为30 min;HRP-IgG与血清作用时间为30 min;底物作用时间为10 min.21份不同猪病的阳性血清中,除3份O型FMD阳性血清为阳性外,其他血清样品为阴性,该方法无交叉反应;敏感性为90.4％,特异性为95.7％;批内和批间精密性试验变异系数(CV)均＜10％.该方法与口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒检测结果的符合率为97％.结论 建立的方法具有良好的特异性及精密性,且操作简便,可用于O型FMDV血清抗体的检测.

[目的]旨在成功建立FMDV C57BL/6小鼠的实验感染模型.[方法]采用体内和体外循环适应传代的方法,选取一株对C57BL/6小鼠不敏感FMDV O/HK/CHA/99 MF4,将其在C57BL/6小鼠(体内)和胎猪肾原代细胞FPK(体外)进行多次循环适应传代.[结果]成功获得一株对C57BL/6小鼠敏感的FMDV O/HK/CHA/99 MF4C5株.[结论]本研究成功建立了FMDV突变株感染C57BL/6小鼠的实验动物模型,为未来FMD疫苗效力的评估和致病性相关的研究奠定了基础.

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的世界上最重要的畜牧疾病之一,严重影响世界畜牧业的发展,而疫苗免疫仍然是对疫情预防和控制的最有效手段.铁蛋白具有自组装和生物修饰的特性,在纳米疫苗等领域具有广阔的应用前景.选用O型口蹄疫病毒的vp1基因和幽门螺杆菌铁蛋白基因,通过融合PCR将vp1基因构建到铁蛋白亚基基因前端,在大肠杆菌中表达后通过His标签进行镍柱亲和层析纯化.将纯化好的重组蛋白进行Western blotting检测、质谱分析和透射电镜观察,发现重组蛋白VP1-Ferritin在大肠杆菌中获得表达,并可自组装成纳米颗粒.

为构建表达O型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)衣壳蛋白的复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)为载体的重组腺病毒,本研究设计、合成特异性引物并扩增出FMDV-OZK93的P12A、3B3C基因,通过融合PCR方法连接2个片段,获得P12A3B3C基因后插入到pDC316-mCMV-EGFP质粒,构建了能够表达FMDV-OZK93株衣壳蛋白前体P12A和3B3C蛋白酶的重组穿梭质粒pDC316-mCMV-EGFP-P 12A3B3C.利用AdMaxTM腺病毒包装系统进行重组腺病毒rAdv-P12A3B3C-OZK93的包装、鉴定及扩增;并感染人胚胎肾细胞HEK-293进行表达验证.将鉴定正确且高度纯化后的重组腺病毒肌肉免疫小鼠进行免疫原性分析.结果显示,rAdv-P12A3B3C-OZK93在病毒传代过程中目的基因稳定存在,且病毒滴度可达1×109.1 TCID50/mL.间接免疫荧光和 Western blotting结果均表明rAdv-P12A3B3C-OZK93在HEK-293细胞中表达了FMDV特异性蛋白P12A和VP1.PK细胞感染实验证明rAdv-P12A3B3C-OZK93可感染猪源细胞,这为构建的rAdv-P12A3B3C-OZK93用于猪对抗FMDV的免疫与保护奠定了基础.相比于FMDV灭活疫苗免疫的小鼠,重组腺病毒免疫小鼠后可诱导机体产生更高水平的FMDV特异性抗体以及γ-IFN和IL-10应答反应,表明该重组腺病毒可对动物机体产生良好的免疫原性,为后续研制新型口蹄疫活载体疫苗奠定了重要基础.