揭示热带木本豆科与樟科植物的叶内生细菌群落的物种与代谢功能群组成差异及其驱动因子有助于理解热带森林的植物适应性和生物多样性维持机制.本研究采用Illumina Miseq测序平台检测海南尖峰岭热带山地雨林中豆科与樟科植物叶内生细菌,并采用FAPROTAX微生物地球化学循环代谢功能数据库注解内生细菌功能.从豆科植物的长脐红豆(Ormosia balansae)、软荚红豆(O.semicastrata)与樟科植物的厚壳桂(Cryptocarya chinensis)、硬壳桂(C.chingii)共4种植物检测到叶内生细菌可操作分类单元(operational taxonomic units,OTUs)达1,123个,隶属于21门36纲51目92科160属,其中有600个OTUs被鉴定为变形菌门,72个OTUs为酸杆菌门,分别占总细菌序列数的57.17％和15.12％;噬纤维菌目的薄层菌属(Hymnenobacter)及根瘤菌目的甲基杆菌属(Methylobacterium)的细菌物种最丰富,分别达37和27个OTUs.叶内生细菌物种组成在豆科与樟科植物之间存在显著差异(ANOSIM:R=0.5792,P=0.004).基于群落非参数性检验的环境向量拟合分析(environmental vector fitting,Envfit)结果表明,对叶内生细菌群落物种组成影响最大的是叶全钾含量(leaf potassium content,LKC)与比叶面积(specific leaf area,SLA).有明确分类信息且功能己注释的叶内生细菌OTUs占总OTU数的54.63％,涉及28类代谢功能群,其中固氮功能群、好氧化能异养功能群、纤维素分解功能群、甲醇氧化功能群、甲烷氧化功能群、尿素分解功能群等6类功能群的相对多度在非豆科的厚壳桂属(Cryptocarya)显著高于豆科的红豆属(Ormosia)植物.非度量多维尺度分析(non-metric multidimensional scaling,NMDS)结果表明,细菌代谢功能群主要受SLA和叶全磷含量(leaf phosphorus content,LPC)影响.尖峰岭热带山地雨林非豆科植物叶内生细菌群落中相对多度较高的碳、氮代谢功能群可能是其对低有效养分的土壤环境的适应性机制之一.

[背景]禾本科植物中存在着丰富的内生固氮菌资源,可为植物的生长、营养利用、增强抗逆性等起到重要的促进作用.[目的]揭示巨菌草不同生长时期根、茎、叶内生固氮细菌的组成及其变化.[方法]采用高通量测序技术对不同生长时期的巨菌草根、茎、叶内生固氮菌群进行群落分析.[结果]不同生长时期巨菌草根、茎、叶的15个样本分别得到4-6万条有效序列,主要分布在360 bp左右.根部巨菌草内生固氮菌群在成熟期最高,茎部和叶部均为拔节期最高,同一生长时期则为根＞叶＞茎,变化趋势与巨菌草植物样本的固氮酶活性变化趋势一致,其主要的菌群门类为变形菌门(Proteobacteria)和蓝藻菌门(Cyanobacteria),主要核心属为克雷伯氏菌属(Klebsiella)、草螺菌属(Herbaspirillum)和慢生根瘤菌(Bradyrhizobium).整体上看,根、叶部来源的各自微生物菌群组成较为接近,茎部来源的菌群与根部、叶部有交叉,成熟期根部的联合固氮菌群种类和丰度最高.典范对应分析表明各来源样本固氮菌群的组成主要受环境温度影响,其次为湿度和pH.[结论]不同生长时期巨菌草根、茎、叶固氮菌群的组成及丰度存在着较大的差异,本研究可为巨菌草内生固氮菌群资源的开发和利用以及种质资源库的建立提供基础依据.

为探究宁夏枸杞叶内生细菌群落随生长变化动态及其影响因素,利用高通量测序技术分析宁夏枸杞幼叶、成熟叶和老叶3个典型生长时期叶内生细菌群落,并通过典范对应分析和方差分解分析探究气候因子代表的宿主植物生活环境、叶光合参数代表的宿主器官生理状态、叶内微生物生长可利用营养物质代表的植物体内内生菌生存微环境等三类环境因子对叶内生菌群落动态变化的影响.结果 表明:3个宁夏枸杞叶生长时期内生细菌共28个门、52个纲、118个目、249个科、503个属、738个种、978个OTUs,α多样性及丰富度以幼叶中最多,随着叶片生长而减少,至叶片成熟老化,保持在较低的水平;变形菌门γ-变形菌纲是3个生长时期枸杞叶片中的优势类群,但幼叶内生细菌中优势科属为黄单胞菌科食单胞菌属,成熟叶内生细菌优势科属为假单胞菌科假单胞菌属,老叶内生细菌优势科属为肠杆菌科泛菌属;成熟叶和老叶内生细菌OTU以继承前一个生长时期内生细菌OTU为主;叶内生细菌功能随叶片生长时期改变发生细微变化;不同生长时期影响叶内生细菌群落组成的环境因子不同,以叶内微生物生长可利用营养物质对宁夏枸杞叶内生细菌群落组成影响最大;宁夏枸杞叶内生细菌从各群落特征对不同叶生长时期内外环境变化做出响应,植物体内内生菌生存微环境是影响宁夏枸杞内生菌群落动态变化主要因素.

为了揭示抗菌草药两面针内生真菌的分布和种群特征及其在抗菌研究中的应用潜力,该研究对广西野生两面针内生真菌的分子鉴定、遗传多样性和抗菌活性进行研究.两面针内生真菌分离培养和分子鉴定的结果显示,从两面针植物中分离获得35株内生真菌,隶属于2门4纲10目12科15属,刺盘孢属Colletotrichum和镰孢属Fusarium为优势菌属,均占总菌株数的20％;根、茎和叶内生真菌多样性存在明显差异,茎部内生真菌的Shannon index(H '=1.678)明显较根(0.8821)和叶(0.5154)部高.抗菌活性分析结果显示,14.28％的内生真菌至少对1种病原指示菌有抑菌活性,其中Fusarium sp.ZN-34菌株对大肠杆菌的抑菌效果最强;Fusarium sp.ZN-26菌株对金黄色葡萄球菌的抑菌效果则最好;综合抑菌的广谱性和效能而言,Fusarium sp.ZN-26和Phialemoniopsis pluriloculosa ZN-35对2种病原细菌的抗菌效果较好.以上研究结果表明,广西野生药用植物两面针中蕴藏着丰富多样的内生真菌资源及多种有较好抑菌活性的内生真菌,可为两面针内生真菌抗菌基础物质的提取、分离和分析及天然新颖抗菌剂的开发提供可利用的候选菌株.

[目的]女贞是我国分布广泛的园林绿化树种、药用植物和资源昆虫白蜡虫的优良寄主植物,解析女贞叶、茎、根、根际土壤4种生态位的细菌群落结构、物种组成和多样性特征,为研究女贞及其相关微生物组的互作及开发利用女贞内生和根际细菌资源奠定基础.[方法]以女贞叶、茎、根、根际土壤为研究材料,基于细菌16S rRNA基因V5-V7区,通过Illumina MiSeq扩增子高通量测序和生物信息学分析,比较女贞不同生态位细菌群落结构、物种组成、功能的差异性和相似性.[结果]女贞4种样本共获得168229条有效序列,聚类后共计977个OTU,归属于23门,54纲,138目,227科和399属.不同生态位细菌群落多样性从根际土壤到根、茎、叶自下而上逐渐降低,Shannon指数分别为4.514、3.856、2.704和1.908.β-多样性分析表明,女贞4种生态位细菌群落结构存在显著差异(R=0.8426,P＜0.05),而叶与茎(R=0.4815,P＞O.05)、根与根际土壤(R=0.8889,P＞O.05)的细菌群落结构相对较为相似.在物种组成上,根、茎和叶内生细菌群落中相对丰度较高的为变形菌门和放线菌门,根际土壤中相对丰度较高的为绿弯菌门;在属水平上,女贞核心菌群主要包括红球菌属、马赛菌属、鞘氨醇单胞菌属、伯克氏菌属、慢生根瘤菌属和热酸菌属,其中伯克氏菌属、慢生根瘤菌属等为植物益生菌资源.功能预测结果显示,不同生态位细菌群落的功能以化能异养为主,地上部分(叶、茎)菌群主要在碳、氢循环中发挥作用,而地下部分(根和根际土壤)菌群主要行使与氮循环相关的功能.[结论]女贞不同生态位的细菌群落多样性自下而上呈现过滤选择机制,不同样本细菌群落结构生态位分化特征明显,在物种组成上存在植物区室特异性.女贞相关微生物群中存在多种植物益生菌,值得进一步研究和开发利用.

了解3种淫羊藿内生细菌群落的结构和组成,为淫羊藿内生菌资源的开发及利用提供参考.采用Illumina Miseq高通量测序技术,分析了粗毛淫羊藿、箭叶淫羊藿及巫山淫羊藿新叶和老叶内生细菌群落的结构和组成.3种淫羊藿叶片内生细菌群落组成结果显示,门水平的优势菌群主要包括变形菌门、厚壁菌门和放线菌门,优势菌属主要为甲基杆菌属(Methylobacterium)、鞘氨醇单孢菌属(Sphingomonas)、放线孢菌属(Actinomy-cetospora)、Kroppenstedtia属、泛菌属(Pantoea)及乳杆菌属(Lactobacillus)等.各样品的优势菌属(相对丰度>5％)存在一定差异,如在粗毛淫羊藿样品中甲基杆菌属、鞘氨醇单孢菌属相对丰度较其他样品高(相对丰度不足2％),而Kroppenstedtia属在箭叶淫羊藿样品中的相对丰度较高,乳杆菌属、魏斯式菌属(Weissella)、马赛菌属(Massilia)和泛菌属的相对丰度则在巫山淫羊藿样品中较高;同时,3种淫羊藿新叶和老叶内生细菌群落组成也存在差异,甲基杆菌属、鞘氨醇单孢菌属、Kroppenstedtia属和马赛菌属在老叶中的相对丰度较高,而乳杆菌属、魏斯式菌属和泛菌属在新叶中相对丰度较高,这些结果达到高度一致.优势益生菌的功能主要体现在促进土壤有机物的分解、合成多种次级代谢产物、诱导作物对病原微生物的抗性等方面.不同种淫羊藿叶片内生细菌群落组成不同,同种淫羊藿的新叶和老叶的内生细菌群落结构也存在差异.该研究首次分析了淫羊藿内生细菌的群落结构,为进一步研究淫羊藿内生细菌微生态及功能菌株的开发利用提供参考.

为探究蕲艾(Artemisia argyi var.argyi'Qiai')不同组织内生菌组成及其次级代谢产物的抑菌活性,该研究采用组织培养法对蕲艾根、茎和叶内生细菌进行分离,用滤纸片法检测内生菌发酵液挥发物对6种常见病原菌的抑菌活性,并分别对其最低抑菌浓度(MICs)和最低杀菌浓度(MBCs)进行测定,结合形态观察、生理生化性质及16S rDNA序列测定对分离菌株进行鉴定.结果表明:(1)菌株lzy-21、lzy-20和lzy-1分别具有较强的分泌纤维素酶、蛋白酶和脂肪酶的能力.(2)菌株lzy-20和wnn4-3发酵液挥发物对大肠杆菌、产气肠杆菌和枯草芽孢杆菌的MICs均为16μg·mL-1;对三者的MBCs依次为32、32、16μg·mL-1和16、32、32μg·mL-1.(3)菌株lzy-12对金黄色葡萄球菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌的MICs均为16μg·mL-1,对二者的MBCs分别为32μg·mL-1和16μg·mL-1.(4)菌株lzy-17和lzy-21对小肠结肠炎耶尔森氏菌的MICs均为16μg·mL-1,MBCs分别为16μg·mL-1和32μg·mL-1.其中,菌株lzy-1为首次从植物中分离到的皮提不动杆菌(Acinetobacter pittii),菌株lzy-20、lzy-21和wnn4-3依次为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)、韩国芽孢杆菌(B.koreensis)和暹罗芽胞杆菌(B.siamensis),菌株lzy-12和lzy-17分别为松果黄体杆菌(Luteibacter pinisoli)和嗜烟节杆菌(Paenarthrobacter nicotinovorans).该研究结果为充分利用内生菌资源生产工业用酶以及深入探究蕲艾功能内生菌及其作用机制奠定了基础.

为了探究适用于分离水稻内生细菌的方案以获得水稻内细菌新资源,本研究基于培养组的方法,以水稻3个品种种子及幼苗为材料,从材料表面消毒、菌悬液的制备和培养基配比3个方面进行探究,并对分离获得代表性纯培养物的16SrRNA基因进行测序鉴定.结果表明,75％乙醇和含2％有效氯的次氯酸钠溶液组合对种子先后处理90s和12 min,对植株组织先后处理90s和5 min即可获得良好的消毒效果.水稻种子内生细菌量为105-106CFU/g,其中90％-95％分布于颖壳内,不同品种或同一品种的不同生境来源的种子之间内生细菌群落组成有明显差异;在制备种子菌悬液时需注意控制研磨程度以获得种类丰富的菌落,剥去颖壳有利于分离培养糙米中的内生菌.对于根、茎、叶内生细菌的分离,需要根据材料不同控制接种菌悬液的浓度以获得其中微量的内生细菌;在培养基中添加组织浸提液和延长培养时间至两周以上,可促进根、茎、叶内生细菌的分离培养.采用调整后的方案,本研究对3个水稻品种的种子和它们的植株根、茎、叶内生细菌进行分离培养,分别完成了 71、14、10和2个代表性纯培养物的16SrRNA基因测序鉴定,其中有8株与已知类群模式菌株同源序列相似度在97.22％-98.74％,新种获得率为8.25％.研究结果为分离培养水稻内生细菌新资源提供了方法参考.