目的 基于宏基因组技术研究哈蟆油(OR)对大鼠肠道菌群的影响,用组学技术表征OR的功效.方法 雄性SD大鼠随机分为对照组和OR组.OR组大鼠以200 mg·kg-1 剂量的OR匀浆每日灌胃,对照组以等体积生理盐水灌胃.14 d后,采集大鼠粪便进行宏基因组测序,对测序结果进行基因预测、丰度分析、物种注释及京都基因与基因组百科全书(KEGG)功能注释.结果 在门水平上OR可以显著升高放线菌门相对丰度(P＜0.05),在纲水平上OR可以显著升高放线菌纲相对丰度(P＜0.05),在目水平上OR可以显著升高双歧杆菌目相对丰度(P＜0.05).两组大鼠肠道菌群在门和属水平上的β多样性存在差异.线性判别效应大小分析(LEfSe)筛选出两组间 35种显著差异菌种.KEGG功能注释结果显示,在Level 1 层级上注释到新陈代谢类通路的基因最多.组间差异分析表明,OR组注释到免疫系统、环境适应及癌症相关通路的相对丰度产生变化.结论 改变大鼠肠道菌群相对丰度及多样性、调节脂质及氨基酸代谢通路可能是OR营养保健和治疗疾病的潜在机制.

目的 建立哈蟆油与伪品蟾蜍油、牛蛙油和青蛙油水溶性蛋白的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-polyacrylamide gel electrophoresis,Native-PAGE)和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)鉴别方法,并对2种电泳方法进行比较.方法 采用Native-PAGE和SDS-PAGE两种电泳系统,分别对不同产地哈蟆油与其伪品的水溶性蛋白的组成及其分子量分布范围进行比较研究.结果 Native-PAGE实验结果显示:哈蟆油与桓仁林蛙油均具有6条特征谱带,黑龙江林蛙油具有5条特征谱带,而蟾蜍油、牛蛙油和青蛙油的特征谱带数目分别为2条、1条和1条.SDS-PAGE实验结果显示:哈蟆油、黑龙江林蛙油和桓仁林蛙油均具有11条特征谱带,而蟾蜍油、牛蛙油和青蛙油的特征谱带数目分别为5条、6条和6条.2种电泳图谱中,哈蟆油等正品药材与伪品蟾蜍油、牛蛙油和青蛙油在特征谱带位置等特征上有明显区别.结论 Native-PAGE和SDS-PAGE两种电泳方法均可用于哈蟆油与类似品和伪品的鉴别,为哈蟆油质量评价和控制方法提供了一种简易的鉴别方法.

目的:建立一种适合于哈蟆油药材基因组DNA的提取方法,为该药材的后续分子鉴定奠定基础.方法:采用十二烷基硫酸钠(SDS)法,改良SDS法,Chelex-100法,异硫酸氰胍(GuSCN)法,试剂盒法及改良试剂盒法提取哈蟆油基因组DNA,利用琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度法及细胞色素C氧化酶Ⅰ(COⅠ)序列的引物聚合酶链式反应(PCR)扩增对DNA产量及质量进行检测.结果:Chelex-100法,改良SDS法,GuSCN法及改良试剂盒法均能从哈蟆油药材中提取得到基因组DNA,SDS法和试剂盒法提取不到.其中改良SDS法得到的DNA质量良好,得率高,但操作繁琐;改良试剂盒方法得到的DNA质量较好,但得率低,成本高;Chelex-100法操作简单快速、得率高,但得到的DNA质量较差;GuSCN法提取的DNA含有较多杂质,会抑制PCR反应.结论:Chelex-100法、改良SDS法及改良试剂盒法均可得到满足PCR扩增要求的DNA,实践中可根据条件选择适宜方法来提取哈蟆油基因组DNA.

目的 探讨哈蟆油对哮喘豚鼠模型的影响和作用机制.方法 健康雄性豚鼠60 只,分为空白对照组,模型组,阳性对照组(地塞米松,1 mg/kg),哈蟆油高、中、低(400、200 、100 mg/kg)剂量组,卵清蛋白激发造模,腹主动脉取血,酶联免疫法检测豚鼠血清中IL-4、IL-5、免疫球蛋白IgE含量;HE染色观察肺组织病理学改变.结果 与正常组相比,模型组IL-4、IL-5、IgE数量均显著增加差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组相比,阳性对照组,哈蟆油高、中剂量给药组IL-4、IL-5、IgE数量均极具显著性差异有统计学意义(P<0.01).哈蟆油低剂量组差异具有统计学意义(P<0.05).病理结果模型组平滑肌增厚,炎性浸润较为显著,各给药组均不同程度得到 改善.结论 哈蟆油可缓解哮喘豚鼠模型的症状,其作用途径可能与降低机体炎性因子的分泌、改善免疫平衡有关.

目的 优选复方哈蟆油片配方及提取工艺.方法 设黄芪-红景天(A)、黄芪-哈蟆油(B)、黄芪-红景天-哈蟆油(C)3个药物配伍组,每组分别设3个亚组和空白对照组,给不同剂量及配方的提取物30 d后,观察各组小鼠体质量和负重游泳时间.优选出复方哈蟆油片的最佳配方:采用L9(34)正交试验设计,以黄芪甲苷及红景天苷为考察指标,优选出最佳提取工艺条件.结果 黄芪+红景天+哈蟆油中剂量组小鼠的游泳时间明显长于对照组(P<0.05).复方哈蟆油片最佳水提工艺为加入8倍量水,煎煮3次,每次1.5 h.结论 黄芪+红景天+哈蟆油配方具有显著缓解小鼠体力疲劳的作用.优选的提取工艺对各功效成分提取率均较高,可以为制剂大生产提供依据.

目的 定性分析哈蟆油在大鼠血清当中的有效成分.方法 大鼠经灌胃给予哈蟆油后,腹主动脉采集血并分离血清,采用HPLC法检测哈蟆油含药血清中的亚油酸、1-甲基海因、维生素E、雌二醇.结果 通过参比对照品的保留时间以及与文献资料对比分析,在大鼠含药血清中鉴别出亚油酸、1-甲基海因、维生素E.结论 建立的哈蟆油含药血清的HPLC分析方法有助于阐明哈蟆油的药效物质基础.

采用iTRAQ结合2D LC-MS/MS技术对哈蟆油、青蛙油、蟾蜍油、牛蛙油的蛋白质组进行研究.采用Q Exactive质谱鉴定并经MASCOT软件搜库,对所鉴定的蛋白质进行理化性质分析、层次聚类分析、Gene ontology (GO)功能注释和生物信息学分析.结果共获得2286个肽段,鉴定到1220个蛋白质,其中1212个蛋白质具有定量信息.鉴定得到的蛋白质分子量主要分布在4.1～36.9kDa,占82.79％,等电点主要分布在4.41 ～9.89,占94.84％.对比青蛙油、蟾蜍油和牛蛙油与哈蟆油蛋白质数据库,筛选得到8个差异蛋白(比值＞1.2或比值＜0.83,且P＜0.05),其中显著上调的蛋白质3个,显著下调的蛋白质5个.本结果在蛋白质组成上显示了哈蟆油与伪品蛙油的差异性,为进一步分析哈蟆油中蛋白质成分特点、功能奠定基础.

目的 观察大鼠骨密度(BMD)、生物载荷量及股骨组织切片形态学变化,评价哈蟆油蛋白对去势大鼠骨形态的保护作用.方法 利用动物骨密度仪和小动物骨骼强度测定仪测量大鼠BMD和生物载荷量;采用HE染色法观察大鼠股骨骨小梁数量变化,应用免疫组化技术观察哈蟆油蛋白对ALP和BMP2表达的调节作用.结果 与模型组比较,哈蟆油蛋白明显提高了大鼠的BMD(P ＜0.05),显著改善了股骨的最大载荷量(P ＜0.01);150mg·kg-1哈蟆油给药组的骨小梁的排列更加有序,结构更加完整;同时低剂量和高剂量组的ALP和BMP2呈现阳性表达.结论 哈蟆油蛋白能增强骨强度、降低骨脆性骨折风险,同时能保护骨小梁结构,促进ALP和BMP2的阳性表达,故哈蟆油蛋白对骨组织形态发挥一定的保护作用,可能参与骨代谢平衡,发挥防治绝经后骨质疏松的作用.

目的:了解林蛙主产区的人工驯养现状及存在的问题,探究解决方法.方法:采用实地考察与文献梳理相结合的方法.结果:目前吉林、辽宁两省的林蛙养殖企业主要采用半人工驯养方式,其中在养殖品种、放养期管理以及产业链的升级上存在一定问题.结论:建议采用DArT多样性芯片技术标记或SSR微卫星分子标记以及膜基因芯片等技术,对人工驯养林蛙的优良品种繁育和遗传系谱进行确认;通过引进电子标识技术,对放养期林蛙种群的生长习性、生境特点以及病害、物种侵袭等实时监控;以“产、研、销”结合的方式,解决人工驯养林蛙品种来源、放养期监控及产业链发展等问题.

目的:探讨哈蟆油对哮喘模型豚鼠抗哮喘作用,并初步研究其作用机制.方法:将豚鼠随机分为空白组、模型组、地塞米松1 mg/kg组、蛤蟆油100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg组,并建立卵清蛋白特异性致敏诱导的豚鼠哮喘模型,分别灌胃给予各组相应药物或生理盐水,连续2周.酶联免疫法检测模型动物血清中炎性因子IL-4、IL-5、IL-13、IgE的浓度;采用流式细胞术检测豚鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞(EOS)的凋亡情况;血细胞分析仪检测血细胞计数;同时制备肺组织常规病理切片,观察模型动物肺组织病理学变化.结果:与空白组相比,模型组动物全血中EOS、NEU％、WBC细胞计数以及血清中IL-4、IL-5、IL-13、IgE含量明显升高,蛤蟆油各组上述指标与模型组比较明显降低,其中200 mg/kg、400 mg/kg组动物血清中IL-4、IL-5、IL-13、IgE含量较模型组显著下降.EOS凋亡比例显著增加,病理切片显示其炎性损伤程度较模型组有显著的改善.结论:蛤蟆油能够有效地降低模型动物血中IL-4、IL-5、IL-13、IgE的含量,促使肺组织和气道壁嗜酸性粒细胞凋亡,恢复血液中EOS、NEU％、WBC的正常水平,改善肺组织病理损伤,对哮喘有一定的治疗作用.