目的:筛选肠道病毒71型(EV71)中和表位，确定诱导机体免疫应答的特定最短氨基酸基序，为合成肽疫苗研发提供理论依据。方法:利用噬菌体随机十二肽库淘选EV71中和抗体特异性结合克隆并测序，推导出中和表位的关键序列。合成含有关键序列且N端乙酰化(AC)和C端连接血蓝蛋白(KLH)的系列肽段，免疫小鼠后收集血清，经Western blot、ELISA和中和试验验证肽段的免疫原性以及免疫后血清的中和活性。结果:经过3轮淘选和克隆测序后，分析确定关键基序为KQEKDL。Western blot结果表明修饰后的含关键基序的系列肽段免疫小鼠获得的血清与EV71和VP1蛋白均有不同程度结合。ELISA结果表明仅含有最短关键基序的合成肽段(AC-KQEKDL-KLH)免疫后血清对其余3条肽段及EV71的反应最强。中和试验结果表明该肽段免疫后血清的中和效价也最高。结论:利用噬菌体随机肽库技术成功筛选出EV71中和表位，确定KQEKDL关键基序可能是诱导机体免疫应答的特定最短氨基酸序列，为了解免疫应答机制、免疫原性评价及多肽疫苗的研发提供理论依据。

目的:探讨体内噬菌体展示技术筛选的人髓样乳腺癌Bcap-37细胞特异性结合肽的性质和结合效果，为乳腺癌早期诊断提供分子靶向探针。方法:制备人髓样乳腺癌Bcap-37细胞荷瘤裸鼠模型，采用噬菌体环七肽库进行3轮体内筛选。免疫组织化学法检测筛选的噬菌体在肿瘤及正常组织中的分布情况。酶联免疫吸附试验（ELISA）鉴定单克隆噬菌体对Bcap-37细胞的亲合力。提取阳性单克隆噬菌体DNA并测序，选取重复率高的序列合成多肽，制备光学分子探针，应用荧光分子成像验证合成的多肽在荷瘤小鼠体内对乳腺移植瘤的特异性和靶向性。结果:第3轮体内筛选的噬菌体回收率为第1轮的107.2倍。免疫组织化学结果显示，随筛选轮次增加，肿瘤组织中结合的噬菌体依次增加；肿瘤组织结合的噬菌体多于正常组织（肺脏、骨骼肌、肝脏、肾脏），肿瘤组织切片扫描图像的吸光度（ A）值均较正常组织高，差异均有统计学意义（均 P<0.05）。ELISA结果显示，随机选取的50个单克隆噬菌体中，22个为阳性（亲合力≥2）。阳性单克隆噬菌体DNA测序分析后，得到4条有重复的氨基酸序列，选择重复率最高的氨基酸序列CSPLNTRFC，化学合成异硫氰酸荧光素（FITC）标记的CSPLNTRFC多肽。Bcap-37细胞荷瘤裸鼠模型体内验证实验显示，FITC-CSPLNTRFC多肽能明显富集在乳腺移植瘤组织。 结论:利用体内噬菌体展示技术能够筛选出可与人髓样乳腺癌Bcap-37细胞特异性结合的多肽CSPLNTRFC，有助于进行乳腺癌早期诊断的体外研究。

目的 从应用噬菌体展示随机肽库技术和生物信息学方法筛选出的候选人精子特异性抗原表位肽中鉴定新的人精子特异性抗原表位.方法 多肽固相合成法合成候选人精子特异性抗原表位肽单体和三聚体.斑点免疫印迹法和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测与抗精子抗体(ASA))阳性血清的免疫反应.ELISA检测免疫小鼠血清抗候选人精子特异性抗原表位肽抗体滴度.计算机辅助精子分析检测候选人精子特异性抗原表位肽免疫小鼠血清对人精子的作用.结果 高效液相色谱法和质谱法测定结果显示,合成的候选人精子特异性抗原表位肽纯度和结构与设计相符.斑点免疫印迹法和ELISA检测结果显示,氨基酸序列为n-TRRIHRHMTIRR-c的候选人精子特异性抗原表位肽及其三聚体与35 例ASA阳性血清中的17 例呈较强的免疫反应.该候选人精子特异性抗原表位肽及其三聚体免疫小鼠血清处理人精子后,精子活力相关参数较对照组均明显降低(P<0.05),其中三聚体导致的精子活力相关参数下降尤为明显(P<0.01).结论 氨基酸序列为n-TRRIHRHMTIRR-c的十二肽具有人精子特异性抗原表位,是一种新的人精子特异性抗原表位肽.

目的 探讨噬菌体展示技术筛选胃癌高表达CD44分子特异性多肽序列的可行性.方法 使用噬菌体展示随机十二肽文库,以CD44纯化蛋白为筛选靶点,进行4轮亲和力筛选.从第四轮的洗脱物中随机挑选30个噬菌体克隆,对这些克隆进行测序并对序列进行生物信息学分析.通过ELISA法检测噬菌体克隆对CD44分子的亲和力,挑选阳性克隆,再通过细胞免疫荧光法进一步鉴定阳性克隆.结果 从第4轮的洗脱物中随机挑选的30个噬菌体克隆中共有7种多肽序列,重复20次六肽基序WHXXXX.该基序与CD44透明质酸结合域能很好地结合,ELSIA法挑选出 S1、S2、 S5、 S7 四个阳性克隆.细胞免疫荧光法鉴定出对 CD44 亲和力最好的克隆为S1-WHXXXXXXQQA.结论 通过噬菌体展示技术筛选S1-WHXXXXXXQQA多肽序列对CD44的亲和力和特异性最好;该序列有望成为特异性探针用于胃癌的分子影像学诊断.

单克隆抗体具有高度均一性及对靶分子的高亲和性、特异性,已广泛应用于自身免疫性疾病、炎性疾病和癌症的治疗.单克隆抗体与相应抗原的反应性决定于其所识别的抗原表位,确定相应表位在抗原结构上的位置是单克隆抗体筛选中的关键步骤.本文主要对几种单克隆抗体表位的分析方法,包括ELISA法、生物酶解法及化学切割法、噬菌体随机肽库、X-射线晶体学、丙氨酸扫描、氢氘交换质谱(hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry,HDX-MS)、生物信息学表位预测方法的原理、特点及研究进展作一综述.

目的 利用噬菌体展示技术筛选卵巢癌细胞HO-8910表面特异性结合肽.方法 利用噬菌体展示技术筛选卵巢癌细胞株HO-8910,经过3轮生物淘洗,随机挑选21个噬菌体单克隆进行ELISA试验,挑选亲和力高的17个噬菌体进行DNA序列测定,随后利用噬菌体结合实验、免疫细胞染色、免疫荧光染色、竞争抑制等实验鉴定阳性噬菌体的特异性.结果 展示短肽MRMTIIN的噬菌体克隆对HO-8910细胞株有较高的亲和力和特异性.结论 噬菌体展示技术筛选的短肽MRMTIIN可为上皮性卵巢癌的早期诊断提供新的思路.

目的:利用噬茵体7肽库筛选子宫内膜异位症细胞表面的特异性结合肽.方法:利用噬菌体展示技术体外快速差减筛选子宫内膜异位症异位内膜细胞和在位内膜细胞,经过连续5轮生物淘洗,随机挑选50个噬茵体克隆,通过ELISA筛选并进行DNA测序,再通过噬茵体竞争抑制试验来验证阳性噬菌体的亲和性.结果:①经过ELISA实验,其中OD450值大于0.5的共有13个噬菌体克隆被选出,经DNA测序,13个噬菌体克隆中包含6个不同的氨基酸序列,其中5个克隆有共同序列为CGCACCCGCCTGCATACCCGC,其相应的氨基酸序列为RTRLHTR.②多肽RTRLHTR与子宫内膜异位症细胞的结合能力呈多肽剂量依赖性降低,而对照组多肽没有显示这种特异性结合活性.结论:噬茵体展示技术筛选的多肽RTRLHTR可望为子宫内膜异位症早期诊断及治疗提供新的方向.

目的 用T7噬菌体展示技术(phage-displayed technique,PDT)筛选与可溶性多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1(soluble leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 1,sLRIG1)相互作用的蛋白,为进一步研究sLRIG1作用于人脑胶质瘤的机制找到突破点.方法 利用BacPAK6杆状病毒蛋白表达系统(baculovirus expression system,BEVS)获得人sLRIG1重组蛋白,以该蛋白为靶标,采用亲和淘洗方法经6轮筛选人肝细胞cDNA T7噬菌体展示文库;随机挑选96个筛选到的噬菌体行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳回收DNA片段并送测序.结果 经过6轮筛选,噬菌体投入和产出量比达1.85×106 PFU,趋于稳定.回收的DNA片段多在250～750bp,纯化回收后得到35个克隆样本,送测序后得到35条有效表达序列标签,对其行同源性搜索及功能预测等生物信息学分析,最终获得12个可能与sLRIG1蛋白有相互作用的蛋白或多肽,这些蛋白大多与肿瘤相关.结论 通过PDT可获得与sLRIG1蛋白相互结合的蛋白,这些结果为下一步研究sLRIG1的生物功能及其对人脑胶质瘤的作用及机制奠定了基础.

目的 利用噬菌体随机七肽库体外筛选与人乳腺髓样癌Bcap-37细胞特异性结合的小分子多肽. 方法 培养人乳腺髓样癌Bcap-37细胞作为靶细胞,人正常乳腺上皮细胞MCF-10A为吸附细胞,将噬菌体展示随机七肽库与人乳腺髓样癌Bcap-37细胞进行减性体外筛选,用ELISA法鉴定噬菌体对人乳腺癌Bcap-37细胞的亲和力.提取亲和力较高的单克隆噬菌体DNA,测定DNA序列并翻译出相应的氨基酸序列,进行同源性分析. 结果 利用噬菌体随机七肽库通过4轮减性筛选获得了与人乳腺髓样癌Bcap-37细胞特异结合的小分子多肽.ELISA法表明,第1,3,5,6,8,12,14,16,17,18和20号单克隆噬菌体与人乳腺髓样癌Bcap-37细胞有很强的亲和力和特异性.测序结果显示,重复性最高的序列为LXRNTNX. 结论 利用噬菌体展示技术体外筛选获得了能与人乳腺癌Bcap-37细胞特异性结合的小分子多肽LXRNTNX,经检索该肽段与已知蛋白尚无同源性,因此它很有可能成为乳腺癌的早期诊断和靶向治疗新的靶点.

目的 评价RhD多肽抑制抗-D抗体与RhD抗原结合的效果.方法 根据随机噬菌体展示文库筛选得到RhD抗原模拟多肽的氨基酸序列,合成RhD多肽.利用生物信息学技术分析多肽理化性质及二级结构,微柱凝胶低离子抗人球蛋白卡凝集抑制试验验证有效多肽,显微镜观察多肽有效抑制浓度,流式细胞仪法检测多肽抑制效果.结果 Peptide 4噬菌体多肽最为稳定,未形成无规则卷曲与抗原性,且抑制IgG型单克隆抗-D与RhD抗原的反应效果较为明显,显微镜观察呈一定的剂量效应.流式细胞仪法显示当Peptide 4浓度达2.5 mg/50μL时对IgG型单克隆抗-D抗体与O型RhD阳性红细胞的凝集具有抑制作用.结论 Peptide 4为有效多肽,对抑制抗-D与RhD抗原的凝集具有一定效果,对RhD蛋白结构与功能研究及抗原性改造,提高临床输血的安全性等具有重要意义.