目的:探讨乳腺癌同源框同源物1（Six1）基因甲基化在病情及预后评估中的价值。方法:选择2015年1月至2017年1月山东省滨州市中心医院诊治的80例乳腺癌患者（乳腺癌组）和50例乳腺良性疾病患者（乳腺良性疾病组），检测两组Six1基因甲基化及mRNA表达情况，比较乳腺癌患者不同临床病理因素中Six1基因甲基化的差异。对比乳腺癌患者中Six1基因未甲基化与甲基化患者生命质量的差异。结果:乳腺癌组Six1基因未甲基化率及mRNA表达情况均高于乳腺良性疾病组，差异有统计学意义（ P<0.05）。HCC1937、MCF-7、Hs 578T及Bcap-37乳腺癌细胞中Six1基因为未甲基化状态。乳腺癌组Karnofsky评分<70分、低分化、肿瘤最大径≥ 5 cm、淋巴结转移数目≥ 9个、有远处转移及TNM分期Ⅲ + Ⅳ期患者Six1基因未甲基化率显著高于Karnofsky评分≥ 70分、高、中分化、肿瘤最大径<5 cm、淋巴结转移数目<9个、无远处转移及TNM分期Ⅰ+Ⅱ期患者[85.7%（18/21）比58.0%（40/69）、92.6%（25/27）比62.3%（33/53）、90.0%（27/30）比62.0%（31/50）、92.9%（26/28）比61.5%（32/52）、100.0%（14/14）比66.7%（44/66）、90.5%（38/42）比55.6%（20/36）]，差异有统计学意义（ P<0.05）。Six1基因未甲基化患者生命质量显著低于Six1基因甲基化患者（ P<0.05）。 结论:Six1基因在乳腺癌中为低甲基化状态，在乳腺癌病情及预后评估中具有重要作用。

目的:探讨柯萨奇病毒和腺病毒受体(coxsackievirus-adenovirus receptor，CAR)在胸腺癌中的表达和溶瘤腺病毒H101抗肿瘤活性之间的关系及其机制研究。方法:实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和Western blot检测胸腺癌组织和细胞中CAR的基因和蛋白质表达量。H101病毒感染Bcap-37、MP59和T1889细胞后，RT-qPCR和半数组织培养感染量(TCID 50)法检测细胞中H101的表达及上清中病毒滴度。不同感染复数(MOI)H101感染T1889细胞后，CCK-8法检测各组细胞的增殖活性，流式细胞术检测细胞凋亡率。不同浓度组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A(Trichostatin A，TSA)处理T1889细胞后检测细胞中CAR的表达量；TSA处理细胞后，感染H101，检测细胞中H101的表达量及病毒滴度，CCK-8法检测细胞活性；TSA处理或TSA＋ERK激活剂TBHQ处理细胞后检测T1889细胞中MARK、ERK1/2的磷酸化水平和CAR的蛋白质表达量。 结果:与癌旁正常组织相比，胸腺癌组织中CAR的基因和蛋白质表达量均显著降低( P<0.01)；胸腺癌MP59细胞和T1889细胞中CAR表达量明显低于胸腺上皮细胞(TEC)和Bcap-37细胞( P<0.01)，H101表达量及上清中H101滴度明显低于Bcap-37细胞( P<0.01)；H101感染细胞48 h后，MP59和T1889细胞活性与Bcap-37细胞相比明显升高，细胞凋亡率明显下降( P<0.01)。不同浓度TSA处理后，T1889细胞中CAR基因和蛋白质水平呈剂量依赖性升高。0.25 μmol/L TSA处理T1889细胞后，H101基因表达量和病毒滴度明显升高( P<0.05)，MAPK和ERK1/2蛋白的磷酸化水平不断下降，CAR表达不断升高；和TSA处理组相比，TSA＋TBHQ处理组细胞内CAR蛋白质表达量明显下降( P<0.01)，p-ERK1/2/ERK1/2比值明显升高( P<0.01)。 结论:TSA通过抑制MARK/ERK1/2通路上调CAR在胸腺癌中的表达，从而增强H101的抗肿瘤活性。

目的:探讨体内噬菌体展示技术筛选的人髓样乳腺癌Bcap-37细胞特异性结合肽的性质和结合效果，为乳腺癌早期诊断提供分子靶向探针。方法:制备人髓样乳腺癌Bcap-37细胞荷瘤裸鼠模型，采用噬菌体环七肽库进行3轮体内筛选。免疫组织化学法检测筛选的噬菌体在肿瘤及正常组织中的分布情况。酶联免疫吸附试验（ELISA）鉴定单克隆噬菌体对Bcap-37细胞的亲合力。提取阳性单克隆噬菌体DNA并测序，选取重复率高的序列合成多肽，制备光学分子探针，应用荧光分子成像验证合成的多肽在荷瘤小鼠体内对乳腺移植瘤的特异性和靶向性。结果:第3轮体内筛选的噬菌体回收率为第1轮的107.2倍。免疫组织化学结果显示，随筛选轮次增加，肿瘤组织中结合的噬菌体依次增加；肿瘤组织结合的噬菌体多于正常组织（肺脏、骨骼肌、肝脏、肾脏），肿瘤组织切片扫描图像的吸光度（ A）值均较正常组织高，差异均有统计学意义（均 P<0.05）。ELISA结果显示，随机选取的50个单克隆噬菌体中，22个为阳性（亲合力≥2）。阳性单克隆噬菌体DNA测序分析后，得到4条有重复的氨基酸序列，选择重复率最高的氨基酸序列CSPLNTRFC，化学合成异硫氰酸荧光素（FITC）标记的CSPLNTRFC多肽。Bcap-37细胞荷瘤裸鼠模型体内验证实验显示，FITC-CSPLNTRFC多肽能明显富集在乳腺移植瘤组织。 结论:利用体内噬菌体展示技术能够筛选出可与人髓样乳腺癌Bcap-37细胞特异性结合的多肽CSPLNTRFC，有助于进行乳腺癌早期诊断的体外研究。

目的:通过体外实验观察β-arrestin2的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对人乳腺癌Bcap37细胞凋亡的影响.方法:针对β-arrestin2基因设计siRNA序列,克隆到空载体PGPU6/GFP/Neo,转化DH5α菌株,提取质粒,进行测序分析.在脂质体lipofectamineTM2000的介导下转染Bcap37细胞,同时转染空白对照组及阴性对照组.转染后用定量Western blot检测Bcap37细胞β-arrestin2蛋白的表达情况,流式细胞仪检测Bcap37细胞的凋亡情况.结果:我们的研究表明,β-arrestin2的siRNA能有效下调β-arrestin2的表达,与对照组相比,β-arrestin2干扰组 β-arrestin2的表达明显下降(P <0.05);β -arrestin2干扰组Bcap37细胞凋亡率显著高于对照组.结论:β-arrestin2干扰组能有效降低β-arrestin2的表达,有效促进Bcap37细胞凋亡;β-arrestin2可能成为乳腺癌基因治疗的一个新靶点.

目的 目前关于PCDHA13启动子甲基化在乳腺癌中的作用机制尚未阐明,文中探讨PCDHA13基因启动子甲基化在乳腺癌发生发展中的作用.方法 应用MassARRAY质谱甲基化测序检测人乳腺癌组织PCDHA13基因启动子甲基化状态,用培养基配置100μmol/L的5-氮杂胞苷储存液,取融合度60％的ZR-75-1细胞分别加入终浓度为5μmol/L(低浓度组)和10μmol/L(高浓度组)的5-氮杂胞苷储存液,对照组仅加入未经处理的培养基,重亚硫酸盐测序法和甲基化特异性PCR法检测人乳腺癌细胞中PCDHA13基因启动子甲基化状态,并结合半定量RT-PCR的方法分析PCDHA13基因甲基化状态与其mRNA表达的关系.Western blot、MTT以及DAPI染色检测5-Aza处理对乳腺癌ZR-75-1细胞增殖和凋亡的影响.结果 乳腺癌组织中PCDHA13基因启动子在第1,4-6,9,10,11个CpG位点甲基化程度明显高于正常乳腺组织[(0.2639±0.1575)vs(0.1612±0.1706)、(0.2509±0.1377)vs(0.1688±0.0992)、(0.4204±0.2087)vs(0.2621±0.1731)、(0.3761±0.1407)vs(0.2824±0.1486)、(0.3922±0.1294)vs(0.3072±0.1496)],差异有统计学意义(P<0.05),MDA-MB-231细胞和Bcap-37细胞中PCDHA13基因启动子CG位点甲基化率在40％～100％;MCF-7细胞中PCDHA13基因启动子甲基化率在10％～50％之间,呈现低甲基化状态,ZR-75-1细胞中PCDHA13基因启动子表现为高甲基化状态,第4个CG位点甲基化率为60％,第1、8、12个CG位点甲基化率为90％,其余CG位点甲基化率全部为100％,PCDHA13基因在MDA-MB-231和Bcap-37细胞系中低表达,MCF-7细胞系中高表达,而在ZR-75-1中表达缺失;对照组ZR-75-1细胞仅扩增出甲基化PCR产物,而经5-Aza处理的ZR-75-1细胞甲基化和非甲基化引物均扩增出特异性条带,并且高浓度组明显高于低浓度组(P>0.05).对照组ZR-75-1细胞PCHDA13基因mRNA表达缺失,经5-Aza处理后,ZR-75-1细胞PCDHA13基因mRNA重新恢复表达,高浓度组PCDHA13基因mRNA表达明显高于低浓度组(P>0.05).对照组ZR-75-1细胞PCHDA13蛋白表达缺失,经5-Aza处理后,ZR-75-1细胞PCDHA13蛋白重新恢复表达,而且高浓度组PCDHA13蛋白表达水平明显高于低浓度组(P>0.05).经5-Aza处理后24、48和72 h后,低浓度组细胞生长抑制率均较高浓度组降低(P<0.05).未经药物处理的ZR-75-1细胞核形态基本正常,未出现细胞凋亡.经5-Aza处理后,部分ZR-75-1细胞出现核固缩、染色质凝集、着色较重的现象.结论 乳腺癌中PCDHA13启动子高甲基化状态与其mRNA低表达或缺失有关,ZR-75-1细胞PCDHA13表达可被5-Aza逆转,PCHAD13基因重新表达后不仅抑制细胞增殖,而且促进细胞凋亡.PCDHA13基因异常甲基化有望成为乳腺癌潜在的肿瘤生物标志物.

目的 探究冬凌草甲素对乳腺癌Bcap37细胞DJ-1蛋白表达的影响及作用机制分析.方法 培养乳腺癌Bcap37细胞,设置6个组别:正常对照组、Bcap37-3μmol/L冬凌草甲素、Bcap37-30 μmol/L冬凌草甲素、Bcap37-300 μmol/L冬凌草甲素、Bcap37-PD98059组和Bcap37-冬凌草甲素+PD98059组.MTT法检测细胞的增殖情况;Western blot检测乳腺癌Bcap37细胞中DJ-1和Erk蛋白的表达情况.结果 冬凌草甲素能有效抑制乳腺癌Bcap37细胞的增殖,且呈剂量依赖性;进一步研究结果提示,冬凌草甲素和Erk的抑制剂PD98059均能有效抑制DJ-1和p-Erk蛋白的表达,联合应用冬凌草甲素和PD98059的效果明显优于单独应用PD98059,而与单独应用冬凌草甲素的效果差异无统计学意义(P＞0.05).结论 冬凌草甲素能有效抑制乳腺癌Bcap37细胞的增殖,其机制可能与抑制Erk信号分子进而影响DJ-1蛋白的表达密切相关,但也存在其他的机制有待进一步研究发现.

目的 通过体外制备γδT细胞,研究γδT细胞对不同肿瘤细胞的杀伤性.方法 采集2018年1月至3月第三军医大学新桥医院招募的20例健康志愿者外周静脉血,使用唑来膦酸联合白细胞介素-2(IL-2)对人外周血单个核细胞(PBMC)进行诱导扩增,获取γδT细胞.流式细胞仪检测第0、7、10、14、16天的细胞纯度.使用CCK-8法检测其对肿瘤细胞的杀伤性,以培养第14天的细胞作为效应细胞,以乳腺癌BCap-37、肝癌Bel-7402肿瘤细胞作为靶细胞,分别在效靶比5∶1、10∶1、20∶1下进行细胞杀伤活性检测.结果 流式细胞检测第0、7、10、14、16天γδT细胞的纯度分别为(3.35±1.32)％、(50.76±5.76)％、(80.43±4.53)％、(90.56±3.34)％、(89.54±4.42)％,差异有统计学意义(F=18.431,P=0.012).5∶1组、10∶1组、20∶1组的γδT细胞对BCap-37的杀伤率分别为(31.3±2.0)％、(48.7±1.6)％、(71.3±2.4)％,差异有统计学意义(F=16.724,P=0.016),进一步两两比较,10∶1组高于5∶1组(P=0.013),20∶1组高于5∶1组(P=0.017),20∶1组高于10∶1组(P=0.011),杀伤率随着效靶比的增高而增大.5∶1组、10∶1组、20∶1组的γδT细胞对Bel-7402的杀伤率分别为(34.5±2.0)％、(52.4±1.9)％、(74.5±1.6)％,差异有统计学意义(F=18.253,P=0.013),进一步两两比较,10∶1组高于5∶1组(P=0.015),20∶1组高于5∶1组(P=0.012),20∶1组高于10∶1组(P=0.015),杀伤率随着效靶比的增高而增大.结论 使用唑来膦酸联合IL-2诱导PBMC可以获得高纯度的γδT细胞,扩增的γδT细胞对BCap-37和Bel-7402肿瘤细胞有明显的杀伤作用.

目的 研究一种新型二氢吡喃并[2,3-c]吡唑类衍生物(36号化合物)的体外抑瘤作用及可能的分子机制.方法 MTT比色法检测36号化合物对人乳腺癌细胞Bcap-37,MCF-7和人肺癌细胞A549体外存活的影响,反转录荧光定量PCR法检测Bcap-37细胞凋亡相关基因p53,p21,Bax和NF-κB mRNA水平,流式细胞术检测Bcap-37细胞周期和细胞凋亡,JC-1荧光探针法测定Bcap-37细胞线粒体膜电位(MMP).结果 36号化合物对Bcap-37,MCF-7和A549细胞存活均表现出浓度依赖性抑制作用,其中对人乳腺癌细胞Bcap-37的半数抑制浓度(IC50)最低,为(22.4±0.8)mg·L-1.与正常对照组相比,36号化合物在25 mg·L-1浓度下使Bcap-37细胞周期阻滞于G1期(P<0.01),早期凋亡细胞显著增加(P<0.01);在50 mg·L-1浓度下,使Bcap-37细胞凋亡相关基因p53,p21,Bax和NF-κB mRNA水平均显著升高(P<0.05,P<0.01);在10,25和75 mg·L-1浓度下,使Bcap-37细胞MMP明显降低(P<0.05,P<0.01).结论 36号化合物具有良好的体外抑瘤作用,可抑制Bcap-37细胞增殖,促进其凋亡,其作用机制与细胞内线粒体通路和细胞外凋亡信号通路的激活相关.

目的 探讨苦参碱对乳腺癌Bcap-37细胞增殖和凋亡的影响.方法 2 mg/mL苦参碱处理Bcap-37细胞后,分别采用四甲基偶氮唑盐(MTF)比色法和流式细胞仪检测细胞增殖和凋亡,免疫印迹法(Western blot)检测细胞周期蛋白D1 (CyclinD1)、c-Myc、生存素(Survivin)、p53蛋白表达,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测p53mRNA表达.然后,在苦参碱作用基础上以p53抑制剂Pifithrin-α处理Bcap-37细胞后,RT-PCR及Western blot检测p53表达水平,MTT法、流式细胞仪、Western blot检测细胞增殖、凋亡及相关蛋白表达.结果 苦参碱处理Bcap-37细胞后,细胞OD值、CyclinD1、c-Myc、Survivin蛋白相对表达量显著降低(P＜0.05),凋亡率、p53蛋白相对表达量显著升高(P＜0.05).加入Pifithrin-α后,与单用苦参碱比较细胞OD值、CyclinD1、c-Myc、Survivin蛋白相对表达量显著上调(P＜0.05),细胞凋亡率、p53蛋白相对表达量均显著下降(P＜0.05).结论 苦参碱可抑制乳腺癌Bcap-37细胞增殖,并促进细胞凋亡,其作用机制可能与上调p53基因表达有关.

目的 探究氯氧喹对不同类型乳腺癌细胞增殖、凋亡及细胞周期阻滞的作用及其可能机制.方法 采用不同浓度氯氧喹处理乳腺癌Bcap37、MDA-MB-231和MDA-MB-453细胞.MTT法检测细胞活力,Annexin V-/PI双染法采用流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期,蛋白印迹法检测凋亡和细胞周期相关蛋白水平的变化.结果 氯氧喹在50 mg·L-1以上对3种细胞系的生长均有明显抑制作用(P<0.05),并呈剂量依赖性,且200 mg·L-1氯氧喹与40 mg·L-1紫杉醇作用相近.氯氧喹可明显诱导3种细胞凋亡(P<0.05),且对MDA-MB-231细胞凋亡的作用尤其明显(P<0.01),并与凋亡相关蛋白cleaved-PARP、cleaved-caspase的表达相一致.氯氧喹还可明显诱导3种细胞G2/M期的数目增加(P<0.05),但在Bcap37和MDA-MB-453细胞更明显,并伴随p21蛋白下调和CDC2蛋白的上调.结论 氯氧喹能有效抑制乳腺癌细胞的增殖活力,在MDA-MB-231细胞以促进凋亡为主,而在Bcap37和MDA-MB-453细胞以细胞周期阻滞为主.