目的:探讨运用机械挤压法制备细胞外基质囊泡模拟物的生物学性能及其对人牙周膜干细胞（PDLSC）细胞活性和成骨分化潜能的影响。方法:胶原酶消化法制备PDLSC来源细胞外基质囊泡，机械挤压法制备亲本细胞来源囊泡模拟物；将获取的天然细胞外基质囊泡和亲本细胞来源囊泡模拟物分为4组：基础培养基培养7 d的PDLSC来源基质囊泡（MVs）和基础培养基培养7 d的PDLSC来源囊泡模拟物（CVMs），成骨诱导培养基培养7 d的PDLSC来源基质囊泡（O-MVs）和成骨诱导培养基培养7 d的PDLSC来源囊泡模拟物（O-CVMs）；透射电镜和纳米颗粒示踪分析观察囊泡形态和大小，免疫荧光检测细胞摄取囊泡情况；以PDLSC作为对照组，细胞活性实验检测囊泡对PDLSC细胞活性的影响，茜素红染色和蛋白质印迹法检测囊泡对PDLSC成骨分化潜能的影响。结果:MVs、O-MVs、CVMs和O-CVMs均表现为圆形囊泡结构（直径50~250 nm），均能被PDLSC摄取，且不影响PDLSC的细胞活性；成骨诱导条件下，O-MVs和O-CVMs孵育的PDLSC相比于对照组细胞形成更多的矿化结节；MVs、O-MVs、CVMs和O-CVMs均能促进PDLSC表达成骨相关蛋白，O-CVMs孵育的PDLSC碱性磷酸酶（1.571±0.348）、骨桥蛋白（1.827±0.627）和骨钙蛋白（1.798±0.537）表达水平均显著高于MVs孵育的细胞（分别为1.156±0.170、1.260±0.293和1.286±0.302）（均 P<0.05），Runt相关转录因子2（1.632±0.455）和骨桥蛋白（1.827±0.627）表达水平均显著高于CMVs孵育的细胞（分别为1.176±0.128和1.428±0.427）（均 P<0.05），MVs、O-MVs和CVMs孵育的PDLSC成骨相关蛋白表达水平差异均无统计学意义（ P>0.05）。 结论:机械挤压法制备的囊泡模拟物与天然细胞外基质囊泡的形态、大小类似，不影响PDLSC的细胞活性，并可在一定程度上促进PDLSC的成骨分化潜能。

目的 探讨microRNA-183(miR-183)对斑马鱼内耳生长发育的影响,及其在顺铂损伤内耳神经丘毛细胞及耳囊、耳石后的再生和生长发育中的作用.方法 利用显微注射技术向斑马鱼受精卵内分别注入miRNA模拟物(agomir)或反义吗啉寡核苷酸(MOs),初步构建miR-183过表达或低表达模型,然后将受精后第72 h斑马鱼浸泡在50μmol/L顺铂溶液中24 h完成最终建模.利用miRNA微阵列分析、RT-qPCR等技术检测miR-183和FOXO1基因表达的改变;通过FM1-43FX荧光染色了解内耳神经丘毛细胞损伤及再生情况;使用正置显微镜观察耳囊、耳石生长发育变化.结果 ①顺铂作用后斑马鱼内耳毛细胞受损且耳囊、耳石生长发育受阻;移除顺铂后内耳毛细胞可再生,耳囊、耳石生长发育也逐渐恢复.②miR-183在移除顺铂后被激活,是斑马鱼幼体miRNA中最有表达差异的成员之一(P＜0.001),且表达量持续上调至峰值后逐渐恢复至正常水平.③与对照组相比,移除顺铂后过表达miR-183组可促进内耳毛细胞数量和耳囊耳石面积的恢复(P＜0.01);低表达miR-183组则使其恢复受到抑制(P＜0.05).④移除顺铂作用后FOXO1被激活,表达量上调(P＜0.01);当过表达miR-183时FOXO1受到抑制,表达下调(P＜0.01);低表达miR-183时FOXO1则表达量上升(P＜0.01).结论 miR-183与移除顺铂作用后内耳毛细胞的再生、耳囊耳石面积生长发育的恢复呈正向调控关系,其机制可能与miR-183对FOXO1的负向调控有关.

目的 探究精母细胞来源外泌体中的piR-1207/2107对精囊上皮细胞(HSVEpiC)精囊凝胶蛋白1(SEMG1)基因表达影响.方法 采用超高速离心法提取精母细胞上清液中的外泌体,运用透射电镜、纳米激光粒度分析仪、外泌体表征蛋白鉴定精母细胞来源的外泌体;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测外泌体中piR-1207/2107的表达情况;采用蛋白免疫印迹(Western blot)检测精母细胞来源的外泌体中PIWIL1蛋白的表达情况;通过生物信息学软件RNAhybrid预测piR-1207和piR-2107可共同调控的潜在靶基因.在HSVEpiC中分别转染piR-1207/2107模拟物(piR-NC-mimic、piR-1207-mimic、piR-2107-mimic)或piR-1207/2107 抑制剂(Anti-piR-NC、Anti-piR-1207、Anti-piR-2107),Western blot 检测转染后各组 SEMG1 蛋白的表达情况.在精母细胞中分别转染Anti-piR-NC、Anti-piR-1207、Anti-piR-2107,提取外泌体与HSVEpiC共培养24 h,采用qRT-PCR检测各组piR-1207/2107的表达情况,并采用Western blot检测SEMG1蛋白的表达情况.结果 透射电子显微镜结果显示,精母细胞来源外泌体呈圆形或椭圆形膜性小囊泡;纳米激光粒度分析仪检测结果显示,外泌体的直径主要分布在100～200 nm之间.qRT-PCR检测结果显示,精母细胞来源的外泌体含有piR-1207/2107;Western blot检测结果显示,精母细胞来源的外泌体中未检测到PIWIL1蛋白.应用生物信息学软件RNAhybrid预测结果显示,piR-1207和piR-2107可以共同靶向结合SEMG1 mRNA的CDS区.HSVEpiC转染piR-1207/2107模拟物后,与piR-NC相比,piR-1207/2107表达量显著升高(P＜0.001),而SEMG1蛋白表达水平显著降低(P＜0.01);HSVEpiC转染piR-1207/2107抑制剂后,与Anti-piR-NC相比,piR-1207/2107表达量显著降低(P＜0.001),而SEMG1蛋白表达水平显著升高(P＜0.05).精母细胞转染Anti-piRNAs后提取外泌体与HSVEpiC共培养,piR-1207/2107表达量显著降低,而SEMG1蛋白表达水平显著增加(P＜0.05).结论 精母细胞来源外泌体中的piR-1207/2107可调控HSVEpiC中SEMG1的表达.

目的:观察阿托伐他汀诱导内皮祖细胞微囊泡(EPC-MVs)增多对ST段抬高型心肌梗死(STEMI)患者心肌细胞的保护作用,并探讨其可能机制.方法:选取2015年2月-2018年2月我院收治的STEMI患者168例,按阿伐他汀剂量分为A组(88例)和B组(94例).所有患者均接受经皮冠脉介入治疗,术后予注射用比伐芦定、硫酸氢氯吡格雷片、阿托伐他钙片治疗.其中,A组予阿托伐他汀钙片20 mg,每日1次;B组予阿托伐他汀钙片20 mg,每日2次.30 d为1个疗程,两组患者均连续治疗至少3个疗程.观察两组患者血脂[总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)]水平(治疗前及治疗后第30、60、90天)和EPCs阳性细胞数(治疗后第30、60天);检测其EPC-MVs微RNA(miRNA)表达谱(治疗后第60天),验证差异表达miRNA的表达情况;分析表达差异最明显miRNA的靶基因及KEGG通路富集情况,并评价其对心肌HCM-a细胞增殖的影响;记录两组患者不良反应发生情况.结果:A组有8例患者脱落,B组有6例患者脱落.治疗前或治疗后30天,两组患者TC、LDL-C、HDL-C水平以及外周血EPCs阳性细胞数比较,差异均无统计学意义(P>0.05);治疗后,两组患者HDL-C水平(治疗后第60、90天)以及B组患者外周血EPCs阳性细胞数(治疗后第60天)均显著升高或增多,且B组显著高于或多于同时间点A组(P<0.05).芯片检测结果显示,与A组比较,B组患者EPC-MVs中表达差异超过1.5倍的miRNA共有16个,其中7个上调、9个下调;差异表达前5位的分别为hsa-miR-126(上调)、hsa-miR-1275(上调)、hsa-miR-7704(下调)、hsa-miR-105-5p(下调)、hsa-miR-3180(下调).荧光定量聚合酶链反应结果显示,B组患者hsa-miR-126、hsa-miR-1275的相对表达量均较A组显著升高,hsa-miR-7704、hsa-miR-105-5p、hsa-miR-3180的相对表达量均较A组显著降低(P<0.05).表达差异最明显的为hsa-miR-126,其靶基因包括Ang-1、PDGF、p38 MAPK、Smad2/3、HIF-1、TGF-β等,参与调节的信号通路主要包括血管生成信号通路、慢性骨髓性白血病相关通路、肾上皮细胞癌相关通路等.CCK-8试验结果显示,hsa-miR-126特异性干扰物组细胞的光密度(OD)值较空白组显著降低,模拟物组细胞的OD值较空白组显著升高(P<0.05).两组患者腹泻、恶心呕吐、皮疹等不良反应发生率比较,差异均无统计学意义(P>0.05).结论:不同剂量的阿托伐他汀均可调节患者体内HDL-C水平,大剂量阿托伐他汀可显著提高EPCs数量,且不会影响用药的安全性.这种作用可能与上调EPC-MVs中hsa-miR-126等的表达从而促进心肌细胞增殖有关.

目的 探讨微小RNA-1270(miR-1270)及其靶基因细胞色素P450 19A1 (CYP19A1)在多囊卵巢综合征(PCOS)患者卵丘颗粒细胞中的表达,并评价其临床意义. 方法 回顾性分析2019年4月至2020年12月期间行IVF或ICSI助孕的PCOS患者(PCOS组)和无PCOS的不孕患者(对照组)的临床资料,记录两组患者的基本临床资料和促排卵情况.并收集两组患者的卵丘颗粒细胞,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测卵丘颗粒细胞中miR-1270与CYP19A1的表达.双荧光素酶报告基因系统检测miR-1270是否靶向结合CYP19A1.将miR-1270的模拟物或抑制剂转染至人卵巢颗粒细胞瘤细胞KGN,采用qRT-PCR和蛋白免疫印迹检测CYP19A1的表达变化,采用ELISA测定KGN细胞培养液上清中雌二醇(E2)的浓度. 结果 PCOS组不孕患者的窦卵泡数、体重指数(BMI)、抗苗勒管激素(AMH)、LH、LH/FSH、催乳素(PRL)、睾酮(T)均显著高于对照组(P＜0.05),获卵数亦显著高于对照组(P＜0.05).与对照组相比,PCOS组卵丘颗粒细胞中miR-1270表达量显著降低(P＜0.05),CYP19A1表达量显著增加(P＜0.05).双荧光素酶报告基因实验证实了CYP19A1和miR-1270之间是直接结合的,并且miR-1270通过靶向结合CYP19A1抑制E2合成. 结论 miR-1270靶向负调控CYP19A1的表达,影响PCOS患者卵丘颗粒细胞中E2的生成,为PCOS患者卵泡发育障碍提出了可能的分子机制.

目的 探讨miR-23a-3p在大鼠卵泡闭锁及卵巢颗粒细胞凋亡过程中的作用机制.方法 分别在SD大鼠卵巢囊中注射miR-23a-3p模拟物/抑制剂,转染72 h后,采用HE染色法检测大鼠卵巢组织形态变化及闭锁卵泡数变化情况;采用生物信息学及荧光素酶报告系统预测并验证miR-23a-3p的靶基因及其结合位点;体外分离培养大鼠卵巢颗粒细胞,并分别转染miR-23a-3p模拟物及抑制剂,采用荧光定量PCR(RT-PCR)法检测转染72 h后颗粒细胞中miR-23a-3p及其靶基因缝隙连接蛋白43(Gja1)的表达情况;Gja1干扰慢病毒转染大鼠颗粒细胞,转染72 h后,采用RT-PCR和Western blot检测大鼠卵巢颗粒细胞中Gja1在mRNA和蛋白水平的表达情况;用流式细胞术检测转染miR-23a-3p模拟物/抑制剂、Gja1干扰慢病毒后卵巢颗粒细胞的凋亡情况.结果 HE染色结果显示,大鼠卵巢囊注射miR-23a-3p模拟物后卵巢中的闭锁卵泡数量显著增高于模拟物对照组(P＜0.05);双荧光素酶报告实验发现,转染miR-23a-3p模拟物组显著降低了荧光素酶活性(P＜0.05);RT-PCR结果显示,转染miR-23a-3p模拟物后卵巢颗粒细胞中miR-23a-3p的表达显著增加,Gja1则显著降低(P＜0.05),而转染miR-23a-3p抑制剂后对内源性miR-23a-3p和Gja1的表达无显著影响(P＞0.05);用Gja1慢病毒干扰载体/对照载体分别转染大鼠卵巢颗粒细胞72 h后,RT-PCR和Western blot结果显示,Gja1干扰组Gja1在mRNA水平及蛋白水平均显著低于对照组(P＜0.05);Western blot检测结果显示,转染miR-23a-3p模拟物后卵巢颗粒细胞中Gja1的表达显著降低(P＜0.05);流式细胞术检测发现,转染miR-23a-3p模拟物后显著促进了卵巢颗粒细胞凋亡,下调Gja1后卵巢颗粒细胞凋亡率显著增加(P＜0.05).结论 miR-23a-3p通过调控靶基因Gja1参与调节大鼠卵泡闭锁及卵巢颗粒细胞的凋亡.

目的:探讨miR-130b-3p和其靶基因在多囊卵巢综合征(PCOS)患者颗粒细胞中表达的意义.方法:选取2019年10月至2020年6月于我院就诊且行体外受精/卵泡浆内单精子显微注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)助孕治疗的35例PCOS患者作为PCOS组.另招募年龄、体质量指数(BMI)等相匹配的卵巢功能正常因男方因素或者单纯输卵管因素接受IVF/ICSI-ET助孕治疗的30例患者作为对照组.采用密度梯度离心法收集纯化颗粒细胞;利用生物信息学技术预测miR-130b-3p的下游靶基因;利用双荧光素酶实验验证miR-130b-3p的靶基因,在转染实验中将细胞分为miR-130b-3p模拟物组、miR-130b-3p抑制物组和各自的对照组;采用CCK8法检测细胞的增殖;采用流式细胞仪检测人卵巢颗粒细胞瘤细胞(KGN细胞)的凋亡指数;采用蛋白印迹法检测Smad4的表达水平.结果:PCOS组miR-130b-3p的表达水平(1.45±0.20)显著高于对照组(0.82±0.17) (P ＜0.05);KGN细胞miR-130b-3p的表达水平(2.30±0.19)显著高于人正常卵巢上皮细胞(ISOE80细胞)(0.98±0.05) (P ＜0.05);miR-130b-3p模拟物组的KGN细胞增殖活性显著高于其他3组,而凋亡率显著低于其他3组,均P＜0.05.双荧光素酶实验证实,miR-130b-3p与Smad4具有靶向调节关系.PCOS组的Smad4蛋白的表达水平显著低于对照组,KGN细胞Smad4的蛋白表达水平显著低于ISOE80细胞,均P＜0.05.结论:miR-130b-3p调节PCOS患者颗粒细胞的增殖和凋亡,参与PCOS的发病.

目的 探讨miR-124修饰的大鼠牙髓干细胞(rDPSCs)来源外泌体对巨噬细胞极化的影响.方法 从SD大鼠牙髓中分离出rDPSCs,流式细胞术鉴定rDPSCs表面标志物CD14、CD34、CD45、CD90、CD105、CD146的阳性比率;油红O染色、茜素红S染色观察rDPSCs成脂成骨能力.利用细胞转染技术将miR-124模拟物(miR-124 mimics)及其阴性对照(miR-NC)转染于rDPSCs,分组为空白组、miR-NC组、miR-124组,并提取转染后rDPSCs的外泌体,分别命名为Exosome组(Exo组)、Exo/miR-NC组、Exo/miR-124组,透射电镜观察外泌体形态;Western blot检测外泌体标志蛋白CD63和CD81表达水平;qRT-PCR检测rDPSCs及rDPSCs外泌体中miR-124表达水平.将25只大鼠随机分为sham组、model组、rDPSCs Exo组、rDPSCs Exo/miR-NC组和rDPSCs Exo/miR-124组,每组5只,构建皮肤缺损模型,分别于皮肤缺损相应区域注射30μl对应的外泌体进行干预,qRT-PCR检测大鼠创伤组织中miR-124表达水平;ELISA法检测大鼠血清中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、甘露糖受体(CD206)含量;Western blot检测大鼠创伤组织中肿瘤坏死因子(TNF)-α、TNF-1β、白细胞介素(IL)-6、IL-4、IL-10、IL-13蛋白表达.结果 rDPSCs表面标志物CD14、CD34、CD45的阳性比率均低于CD90、CD105、CD146;rDPSCs具有成骨成脂能力;透射电镜可观察到外泌体为大小均一,直径50～100 nm,呈圆形或椭圆形的囊泡结构;CD63和CD81蛋白在rDPSCs外泌体中高表达;与空白组和miR-NC组比较,miR-124组rDPSCs中miR-124表达水平显著升高,且Exo/miR-124组rDPSCs外泌体中miR-124表达水平显著高于Exo组和Exo/miR-NC组(P<0.05);与sham组比较,model组大鼠血清中iNOS含量、创伤组织中TNF-α、TNF-1β、IL-6蛋白表达显著升高,CD206含量、IL-4、IL-10、IL-13蛋白表达显著降低(P<0.05);与rDPSCs Exo组和rDPSCs Exo/miR-NC组比较,rDPSCs Exo/miR-124组中iNOS含量、TNF-α、TNF-1β、IL-6蛋白表达显著降低,CD206含量、IL-4、IL-10、IL-13蛋白表达显著升高(P<0.05).结论 miR-124过表达修饰的rDPSCs外泌体可通过抑制M1型巨噬细胞极化、促进M2型巨噬细胞极化来调控炎性反应.

目的 探讨牙髓干细胞来源胞外囊泡(DPSC-EV)对γ射线导致小鼠骨髓细胞凋亡的抑制作用及机制.方法 使用超速离心法从DPSC中分离DPSC-EV,用Western印迹法鉴定其表面标志物,用纳米颗粒跟踪分析技术(NTA)检测DPSC-EV颗粒数目及粒径大小.细胞处理:①60Coγ射线照射小鼠骨髓细胞FDC-P1,单次照射剂量分别为0,2和6 Gy,实验时间为照射后24和48 h;②FDC-P1细胞经60Coγ射线2和6 Gy照射后立即加入DPSC-EV(终浓度5×1011 L-1)干预24 h;③FDC-P1细胞转染微RNA(miRNA)抑制剂后进行2 Gy照射并立即加入DPSC-EV(终浓度5×1011 L-1)干预24 h;④FDC-P1细胞转染miRNA模拟物后进行2 Gy照射,继续培养24 h.用流式细胞术检测细胞凋亡率,Western印迹法检测胱天蛋白酶3、活化胱天蛋白酶3、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)和活化PARP蛋白表达水平,逆转录实时定量PCR检测细胞miR-100-5p表达水平.结果 ①与细胞对照组相比,60Coγ射线2和6 Gy照射后24和48 h,FDC-P1细胞凋亡率均显著升高(P<0.01),细胞中胱天蛋白酶3和PARP蛋白活化水平均显著升高(P<0.05,P<0.01).②照射后加DPSC-EV处理24 h,FDC-P1细胞凋亡率较2和6 Gy单纯照射组均明显降低(P<0.01),PARP蛋白活化水平显著降低(P<0.05,P<0.01).③经γ射线2 Gy照射后24 h,FDC-P1细胞miR-100-5p表达水平与细胞对照组比较显著降低(P<0.01),DPSC-EV干预可逆转2 Gy照射导致的miR-100-5p表达水平降低(P<0.01);转染miR-100-5p抑制剂后,FDC-P1细胞经2 Gy照射并加入DPSC-EV后,与抑制剂对照组相比,细胞凋亡率显著升高(P<0.01);④ 转染miR-100-5p模拟物后,2 Gy照射,与模拟物对照组相比,FDC-P1细胞凋亡率明显降低(P<0.01).结论 DPSC-EV可能通过上调骨髓细胞中miR-100-5p表达水平而抑制γ射线所致小鼠骨髓细胞凋亡.

目的 通过慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠模型探讨肺泡巨噬细胞对气道上皮细胞增殖和分泌的影响及其相关机制.方法 支气管肺泡灌洗术收集烟熏和脂多糖诱导造模的COPD大鼠肺泡巨噬细胞与16HBE气道上皮细胞共培养.使用外泌体分离试剂盒提取大鼠肺泡巨噬细胞外泌体,PCR检测外泌体差异表达的微小RNA(miRNA).采用miR-380模拟物(miR-380 mimic)过表达miR-380,小干扰RNA(siRNA)敲低16HBE细胞囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR).CCK-8法检测细胞增殖,Transwell?迁移实验检测 16HBE 细胞迁移;Western blot 法检测黏蛋白 5AC(MUC5AC)、MUC5B、MUC2、CFTR 的表达,ELISA检测16HBE细胞上清液肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)含量.结果 COPD大鼠肺泡巨噬细胞促进16HBE细胞的增殖和迁移,上调16HBE细胞黏蛋白和TNF-α、IL-6的表达.COPD组大鼠肺泡巨噬细胞外泌体中miR-380明显上调.过表达miR-380及敲低CFTR均可下调16HBE细胞的CFTR表达并显著增强16HBE细胞的增殖和和迁移能力、促进16HBE细胞MUC5AC、MUC5B、MUC2表达和TNF-α、IL-6分泌.结论 COPD大鼠肺泡巨噬细胞增强16HBE细胞的增殖及黏蛋白表达和炎症因子分泌,可能与COPD肺泡巨噬细胞外泌体过表达miR-380并下调气道上皮细胞CFTR有关.