以解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)为代表的非常规酵母凭借较广的底物利用谱、较强的环境耐受性等优势,已成功实现多种天然产物的高效生产.随着合成生物学及基因编辑技术的发展,针对非常规酵母代谢工程改造的工具和策略也逐渐丰富.本文介绍了几类常见的非常规酵母的生理特性、工具开发及应用现状,并总结归纳了天然产物合成优化中常用的代谢工程策略;最后讨论了现阶段非常规酵母作为天然产物合成细胞工厂的优势和不足,并对后续研究和发展趋势进行了展望.

为了提高甲醇酵母多形汉逊的生长性能并降低发酵成本,对其培养基中维生素和氨基酸有效成分进行优化.通过单因素实验和响应面实验相结合,最终确定了两种优化后的培养基组成,分别是以葡萄糖为碳源时的培养基,(NH4)2 SO42.5 g/L、KH2 PO414.4 g/L、MgSO4·7H2 O 0.5 g/L、trace-metal 2 mL/L、亮氨酸60 mg/L、葡萄糖20 g/L、生物素0.005 mg/L、甲硫氨酸40 mg/L、谷氨酸200 mg/L、天冬氨酸200 mg/L;以甲醇为碳源时的培养基,(NH4)2SO42.5 g/L、KH2PO414.4 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、trace-metal 2 mL/L、亮氨酸60 mg/L、甲醇10 g/L、生物素0.005 mg/L、维生素B11.04 mg/L.这两种培养基分别将菌种生物量(OD600)提高了6倍和1.5倍.优化后的葡萄糖培养基细胞中丙酮酸羧化酶活性提高了1倍,甲醇培养基细胞中丙酮酸脱氢酶酶活性提高3倍以上,丙酮酸羧化酶活性提高了8倍左右.综上,本研究为汉逊酵母大规模发酵提供了参考.

从葡萄、葡萄发酵物、土壤及酒厂设备分离到3 991株新疆本土葡萄酒酵母菌,并通过Wallerstein Laboratory(WL)营养琼脂培养形态分类、代表菌株26S rDNA Dl/D2和5.8S-ITS区域序列鉴定,对新疆葡萄酒酵母菌株进行系统分类和多样性分析,得到22个WL培养类型,7个属13个种.伊犁和于田地区酵母菌种类最多,达10个种;叶城地区和中信国安、乡都酒业、野果林(伊犁)酒厂酵母菌种类最少,仅有1种.新疆优势种为葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae).陆生毕赤酵母(Pichia terricola)、Metschnikowia aff、核果梅奇酵母(Metschnikwoia fructicola)、韩国梅奇酵母(Metschnikwoia koreensis)在新疆地区首次分离鉴定到.对新疆葡萄酒相关的酵母菌群落结构进行全面分析,结果显示新疆与葡萄酒相关的酵母菌丰富多样.为新疆葡萄酒酵母资源的开发利用和葡萄酒的质量控制等奠定了菌种基础.

酵素含有多种微生物,为了探明不同酵素的微生物群落构成及抗氧化活性,本研究以火龙果酵素、蓝莓酵素、桑葚酵素为样品,测定其pH值和总酚含量,以DPPH自由基、羟自由基清除能力为指标分析其抗氧化活性,通过高通量测序分析其细菌和真菌群落结构组成.结果 表明,三种酵素中蓝莓酵素的总酚含量和抗氧化活性最高,pH值最低.三种酵素共获得2 122个细菌OTU和2 592个真菌OTU,α-多样性分析发现样品中的细菌群落多样性均高于真菌群落多样性.三种酵素的优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)和子囊菌门(Ascomycota),其中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)和汉逊酵母属(Hanseniaspora)等菌属的丰度较高且差异较大.微生物群落构成与pH值、总酚含量、羟自由基清除能力、DPPH自由基清除能力具有一定的相关性.本研究结果可为功能性酵素产品的研发优化提供理论参考.

先进的合成生物学技术与传统的分子遗传学技术的结合更有助于实现酵母底盘细胞的快速改造和优化.酵母合成生物学研究最早开始于常规酵母——酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),近些年来又迅速扩展至一些非常规酵母,包括巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)和多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)等.借助合成生物学技术与工具,目前科学家们已经成功开发出了能够高效生产生物材料、生物燃料、生物基化学品、蛋白质制剂、食品添加剂和药物等工业产品的重组非常规酵母工程菌株.本文系统总结了合成生物学工具(主要是基因组编辑工具)、合成生物学组件(主要是启动子和终止子)和相关分子遗传学方法在上述非常规酵母系统(底盘细胞)中的最新研究进展和应用情况,并讨论了其他合成生物学技术在这些非常规酵母表达系统中的潜在适用性和应用前景.这为研究人员利用合成生物学方法在这一新型非模式微生物底盘细胞中设计和构建各种高附加值工业产品的异源合成模块并最终实现目标化合物的高效生物合成提供了科学的理论指导.

脂肪酸作为一种化工原料,在生物能源、化妆品、个人护理产品和工业润滑剂等领域具有广泛应用.多形汉逊酵母因其能够利用甲醇、耐高温、底物谱广等优点,被认为是微生物细胞工厂的理想底盘宿主.本研究首先通过代谢工程构建了产脂肪酸的汉逊酵母细胞工厂.在此基础上,通过发酵条件优化进一步提升了工程菌株生产性能.在温度37℃、pH 6.4、培养基碳氮摩尔比为120、种子液OD600在6-8之间时,摇瓶中工程菌脂肪酸产量达到1.86 g/Lo在发酵罐中,采用溶氧(DO)关联法控制补料速度,初始培养基碳氮摩尔比为17.5,在DO高于30％时,补料碳氮摩尔比为120的葡萄糖培养基,脂肪酸产量达到18.0 g/L,显示了汉逊酵母作为脂肪酸合成细胞工厂的潜力,为实现工业化奠定了坚实的理论与应用基础.

多形汉逊酵母可以利用甲醇作为唯一的碳源和能量来源,是构建微生物细胞工厂的潜在宿主,在代谢工程改造和重组蛋白生产中引起了广泛关注.在合成生物学研究和代谢工程改造过程中,通常需要改变相关基因的转录水平来调节代谢通量,而这一过程需要借助不同种类、不同表达强度的启动子来实现.因此,对汉逊酵母糖酵解途径和活性氧(ROS)防御途径相关基因启动子进行挖掘,将其与GFPuv融合,通过测定荧光值的大小,分析汉逊酵母中相关启动子对不同碳源的响应情况及其表达强度.结果 发现:在汉逊酵母中,含有多种不同强度的甲醇诱导型和组成型启动子,包括:强甲醇诱导型启动子PsoDI,强组成型启动子PADH2-1和PGAP;中等强度甲醇诱导型启动子PPGM2、PsoD3和PsoD2,中等强度组成型启动予PPFK2、PGpi和PADH2-2;弱甲醇诱导型启动子PGSH、PMSR和弱组成型启动子PPGM1、PSOD4和PGPX.这一研究结果将促进多形汉逊酵母在代谢工程改造和相关基础研究中的应用,为实现汉逊酵母细胞工厂提供理论依据.