磁分离是从生物样本中富集特定目标物的常用方法.传统特异性磁分离方法一般通过将抗体与磁珠偶联获得免疫磁珠的方式用于特定目标物的捕获,但由于抗体有成本高、捕获目标物后不易释放等缺点,免疫磁珠难以满足众多研究领域对同时满足目标物大批量、高特异性富集的需求.核酸适配体同抗体一样具备目标物高特异性捕获的能力,相较抗体具有制备成本低、结构简单和化学稳定性高等优点,更适合用来大批量、高特异性富集特定目标物,因此在本研究中,本文利用石墨烯对单链和双链核酸的吸附能力不同的特性,以CD63适配体为例设计了一套可以将适配体展示于石墨烯表面并用于捕获、富集和释放目标物的方法.该设计主要包括2个单元,一是可以贴附于石墨烯表面并将CD63适配体展示于石墨烯外的双链寡核苷酸支架,二是采用与支架足部序列互补的单链寡核苷酸,将所捕获的目标物从石墨烯表面解吸附.本研究首先以氧化石墨烯(GO)纸为石墨烯界面,通过对支架或CD63蛋白等进行荧光标记,并对比支架释放前后及CD63蛋白捕获前后GO纸表面荧光强度变化表示其支架释放效果与CD63蛋白捕释情况,随后应用氨基修饰的石墨烯壳铁氮磁珠搭载CD63适配体双链支架,用于捕获细胞裂解液中CD63蛋白.结果表明,该支架可以将适配体展示于石墨烯表面捕获CD63蛋白并可以可控释放,使用挑选的改性石墨烯磁珠搭载该适配体双链支架,可以用于细胞裂解液中CD63蛋白的捕获.该方法有望实现多种蛋白质的特异性富集或通过捕获外泌体膜蛋白而富集外泌体等多种用途.

该研究旨在通过观察苓桂术甘汤(Linggui Zhugan Decoction,LGZGD)含药血清对心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)纤维化及Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路蛋白分子表达的调控机制.制备空白血清和LGZGD含药血清,胰酶-胶原酶依次消化并结合差速贴壁法分离培养原代CFs,采用免疫荧光标记鉴定原代CFs.设正常对照组,模型组,20％空白血清组,5％、10％、20％LGZGD含药血清组.分别用20％空白血清,5％、10％、20％LGZGD含药血清预处理12 h,除正常对照组,其余5组均加入过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)刺激细胞,建立原代CFs纤维化模型.采用划痕愈合实验观察细胞迁移能力,ELISA法检测Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ,Col Ⅰ)、Ⅲ型胶原(collagen Ⅲ,Col Ⅲ)含量,Western blot法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Wnt1、糖原合酶激酶 3β(glycogen synthase kinase 3 beta,GSK-3β)、磷酸化糖原合酶激酶 3β(phospho synthase kinase 3 beta,p-GSK-3β)、β-catenin 及细胞核β-catenin 的蛋白表达,RT-qPCR 检测 β-catenin、基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotein 9,MMP9)的基因表达,免疫荧光技术检测关键蛋白α-SMA、β-catenin的表达及定位.制备Wnt1过表达CFs,采用H2O2处理CFs.设正常对照组、模型组、20％LGZGD含药血清组、空载质粒+20％LGZGD含药血清组、Wnt1过表达+20％LGZGD含药血清组.采用ELISA法检测Col Ⅰ、Col Ⅲ的含量与其比值,Western blot法检测α-SMA和Wnt1、GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin及细胞核β-catenin的蛋白表达,RT-qPCR检测β-catenin、MMP9的基因表达.免疫荧光染色显示,心肌成纤维细胞Vimentin表达阳性,呈绿色,胞核为蓝色,纯度大于90％,鉴定是原代CFs.结果显示,与正常对照组相比,模型组CFs 愈合率增强,Col Ⅰ、Col Ⅲ 含量升高,Col Ⅰ/Col Ⅲ 比值增大,α-SMA、Wnt1、p-GSK-3β、β-catenin、核β-catenin 蛋白表达上调,GSK-3β蛋白表达降低,β-catenin、MMP9 mRNA表达显著升高,β-catenin、α-SMA荧光强度明显增强,表达量明显增多;与模型组相比,5％、10％、20％LGZGD含药血清能显著抑制细胞迁移能力,减少Col Ⅰ、Col Ⅲ的含量,降低Col Ⅰ/Col Ⅲ比值,下调α-SMA、Wnt1、p-GSK-3β、β-catenin、核 β-catenin 蛋白表达,提高 GSK-3β 表达,减少 β-catenin、MMP9 的 mRNA 表达,降低β-cate-nin、α-SMA荧光强度和表达量;与空载质粒+20％LGZGD含药血清组比,过表达Wnt1后,LGZGD作用被显著逆转.LGZGD能够减少胶原纤维过度沉积,抑制成纤维细胞过度增生,改善心肌纤维化进程.LGZGD改善心肌纤维化的作用与调控Wnt/β-catenin通路,减少胶原沉积,保护心肌细胞有关.

目的:观察骨髓间充质干细胞（BMSC）来源的外泌体上miR-183、视网膜脱氢酶11（RDH11）的表达，初步探讨两者靶向关系以及对视网膜色素上皮（RPE）细胞的影响。方法:分离培养C57BL/6(C57）小鼠BMSC，鉴定BMSC来源的外泌体。将BMSC分为空白组、模拟空白对照组（mimic-NC组）、miR-183模拟组（miR-183-mimic组）。参照文献方法培养C57小鼠、视网膜变性10（rd10）小鼠RPE细胞。来自rd10小鼠的RPE细胞转染BMSC外泌体并共培养后分为对照组、外泌体组、mimic-NC-外泌体组（mimic-NC-exo组）、miR-183-mimic-外泌体组（miR-183-mimic-exo组）。采用实时荧光定量聚合酶链反应、蛋白免疫印迹法检测C57小鼠、rd10小鼠以及各组RPE细胞中miR-183、RDH11 mRNA和蛋白相对表达量。生物信息学网站及双荧光素酶报告分析miR-183与RDH11的靶向关系。细胞计数试剂盒8检测BMSC外泌体上miR-183对RPE细胞增生的影响；原位末端标记法检测RPE细胞凋亡情况。多组间比较采用单因素方差分析。结果:与C57小鼠比较，rd10小鼠RPE中miR-183相对表达量下调，RDH11 mRNA相对表达量上调，差异均有统计学意义（ t=5.230、8.548， P=0.006、0.001）。与空白组、mimic-NC组比较，miR-183-mimic组外泌体中miR-183 mRNA相对表达量显著上升（ F=60.130， P<0.05）。共培养24 h时，外泌体进入RPE细胞。与mimic-NC-exo组比较，miR-183-mimic-exo组RPE细胞中miR-183 mRNA相对表达量显著升高（ t=7.311， P=0.002），细胞增生能力增强（ F=10.949， P＝0.012）、凋亡数量减少（ t=4.571， P=0.002），差异均有统计学意义。生物信息学网站及双荧光素酶报告证实miR-183与RDH11具有靶向关系。与mimic-NC组比较，miR-183-mimic组外泌体中RDH11 mRNA及蛋白相对表达量均降低，差异有统计学意义（ t=5.361、6.591， P=0.006、0.003）。共培养后，与对照组比较，外泌体组RPE细胞中RDH11 mRNA及蛋白相对表达量差异无统计学意义（ t=0.169、1.134， P=0.874、0.320）；与mimic-NC-exo组比较，miR-183-mimic-exo组RPE细胞中RDH11 mRNA及蛋白相对表达量均降低，差异有统计学意义（ t=5.554、5.546， P=0.005、0.005）。 结论:上调BMSC来源的外泌体miR-183通过靶向抑制RDH11的表达促进RPE细胞体外增生，减少细胞凋亡数量。

目的:探讨Warthin瘤样甲状腺乳头状癌（WLPTC）的临床病理学特征。方法:收集北京市顺义区医院WLPTC病例5例，对其临床资料、病理形态、免疫标记和分子遗传学特征进行分析，同时复习文献。结果:5例WLPTC组织大体观察，肿瘤切面呈灰白色或灰褐色，实性，质地硬，边界尚清。镜下见肿瘤组织形态似涎腺的Warthin瘤，呈乳头状结构，间质可见大量淋巴细胞、浆细胞浸润，但无明显滤泡形成；表面被覆复层上皮，肿瘤细胞呈多角形，胞质嗜酸性细颗粒状；肿瘤细胞核呈毛玻璃样，并可见核沟及核内包涵体。5例均伴发慢性淋巴细胞性甲状腺炎。1例有颈部淋巴结转移。免疫组织化学染色显示，肿瘤间质内增生的淋巴组织以CD3阳性的T细胞为主，亦可见少量CD20阳性B细胞及CD138阳性的浆细胞。4例患者浆细胞表达IgG4。Ki-67阳性指数为1%~10%。即时荧光定量PCR结果显示，5例患者中，有3例存在BRAF V600E突变，但无一例RAS突变。术后随访1~10年，5例患者均无进展，其中4例无复发和转移，1例曾有淋巴结转移的病例，未见新的转移灶。结论:WLPTC是一种特殊类型的甲状腺乳头状癌，预后良好。正确认识和诊断对临床医师的治疗、预测患者预后具有提示意义。

目的:探讨M1型小胶质细胞源性外泌体（M1-exo）对氧糖剥夺/复氧后神经元损伤的影响，并研究其作用机制。方法:取对数期生长的小鼠小胶质细胞BV2，加入100 μg/L脂多糖（LPS）和20 μg/Lγ-干扰素（IFN-γ）诱导小胶质细胞极化为M1表型，通过蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）、实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）、免疫荧光法鉴定M1型小胶质细胞。收取M1型小胶质细胞的上清液，用ExoQuick-TC TM试剂盒提取M1-exo，通过透射电镜及纳米颗粒粒径分析（NTA）观察外泌体形态，采用Western blotting法检测外泌体标记蛋白白细胞分化抗原（CD9、CD63）的表达。将生长良好的小鼠神经母细胞瘤细胞N2a分为6组：C组细胞常规培养；O组氧糖剥夺3 h后复糖复氧24 h制备N2a细胞氧糖剥夺/复氧损伤模型；E组的N2a细胞氧糖剥夺3 h后复糖复氧并与M1-exo共培养24 h；NC组、M组和I组分别构建阴性对照、过表达和敲低微小RNA-20a-5p（miR-20a-5p）的M1-exo，通过qPCR检测转染是否成功。NC组、M组和I组N2a细胞氧糖剥夺3 h后，与转染后的M1-exo共培养24 h后检测各项指标。采用细胞增殖检测试剂（CCK-8）法检测细胞活力，采用流式细胞术检测细胞凋亡，采用qPCR法检测miR-20a-5p表达。 结果:与M0型小胶质细胞相比，M1型小胶质细胞特异性标志物CD32和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）荧光强度及其mRNA和蛋白表达均明显升高〔CD32（荧光强度）：36.919±1.541比3.533±0.351，CD32 mRNA（2 -ΔΔCt）：4.887±0.031比1.003±0.012，CD32/β-actin：2.663±0.219比1.000±0.028；iNOS（荧光强度）：29.513±1.197比7.933±0.378，iNOS mRNA（2 -ΔΔCt）：4.829±0.177比1.000±0.016，iNOS/β-actin：1.991±0.035比1.000±0.045；均 P<0.01〕，证明M1型小胶质细胞被成功激活。电镜下可见M1-exo为圆形或卵圆形囊泡状小体，并有明显膜性结构，直径范围约100 nm。Western blotting结果显示，M1-exo表达特异性CD63和CD9蛋白。与C组比较，O组N2a细胞活力明显下降，细胞凋亡率和miR-20a-5p的表达明显升高〔细胞活力（ A值）：0.540±0.032比1.001±0.014，细胞凋亡率：（19.857±0.910）%比（13.508±0.460）%，miR-20a-5p（2 -ΔΔCt）：5.508±0.291比1.033±0.101，均 P<0.01〕。与O组比较，E组N2a细胞活力明显下降，细胞凋亡率和miR-20a-5p表达进一步升高〔细胞活力（ A值）：0.412±0.029比0.540±0.032，细胞凋亡率：（31.802±0.647）%比（19.857±0.910）%，miR-20a-5p（2 -ΔΔCt）：8.912±0.183比5.508±0.291，均 P<0.01〕，说明M1-exo进一步加重了氧糖剥夺/复氧后N2a细胞的损伤。与E组比较，M组N2a细胞活力明显下降，细胞凋亡率和miR-20a-5p表达明显升高〔细胞活力（ A值）：0.311±0.028比0.412±0.029，细胞凋亡率：（36.343±0.761）%比（31.802±0.647）%，miR-20a-5p（2 -ΔΔCt）：32.348±0.348比8.912±0.183，均 P<0.01〕；而I组N2a细胞活力明显升高，细胞凋亡率和miR-20a-5p表达明显下降〔细胞活力（ A值）：0.498±0.017比0.412±0.029，细胞凋亡率：（26.437±0.793）%比（31.802±0.647）%，miR-20a-5p（2 -ΔΔCt）：6.875±0.219比8.912±0.183，均 P<0.01〕。E组与NC组N2a细胞活力、细胞凋亡率和miR-20a-5p的表达比较差异均无统计学意义。 结论:M1-exo加重氧糖剥夺复氧后神经元的损伤，这一损伤作用可能与其携载的miR-20a-5p有关。

目的:探讨CD163在颅内动脉瘤组织和患者血液中表达特征及其作为颅内动脉瘤早期临床筛查指标的可行性。方法:选择新疆医科大学第一附属医院神经外二科自2021年1月至2023年11月收治的28例颅内动脉瘤患者（颅内动脉瘤组），另外选择同期健康管理中心的28例健康体检者作为对照组。收集颅内动脉瘤组中行颅内动脉瘤夹闭手术患者的8份囊性动脉瘤组织和12份颞浅动脉组织样本，采用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测动脉瘤组织、颞浅动脉组织中 CD163 mRNA的表达。采用RT-qPCR检测2组受试者血液中 CD163 mRNA的表达。按随机数字表法选取7例颅内动脉瘤患者、7例对照组受试者，采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测其血浆中CD163蛋白的含量。采用多因素Logistic回归分析颅内动脉瘤发生的影响因素。采用受试者工作特征（ROC）曲线分析血液中 CD163 mRNA表达、血浆中CD163蛋白含量对颅内动脉瘤的诊断价值。 结果:颅内动脉瘤组织中 CD163 mRNA表达水平高于颞浅动脉组织（41.870±20.355 vs. 6.080±5.444），差异有统计学意义（ P<0.05）。颅内动脉瘤组患者血液中 CD163 mRNA表达水平高于对照组[1.969（1.124，2.318） vs. 1.124（0.933，1.379）]，差异有统计学意义（ P<0.05）。破裂颅内动脉瘤组、未破裂颅内动脉瘤组、对照组受试者血液中 CD163 mRNA的表达逐渐下降，差异均有统计学意义（ P<0.05）。女性、男性颅内动脉瘤患者血液中 CD163 mRNA的表达差异无统计学意义（ P>0.05）；ELISA检测显示，颅内动脉瘤组患者血浆中CD163蛋白含量高于对照组[（10.537±1.879） ng/L vs. （8.598±0.885） ng/L]，差异有统计学意义（ P<0.05）。多因素Logistic回归分析结果显示年龄（ OR=0.844，95% CI：0.750~0.951， P=0.005）、血液中 CD163 mRNA的表达（ OR=0.111，95% CI：0.024~0.506， P=0.004）是颅内动脉瘤发生的独立影响因素。ROC曲线分析结果显示，血液中 CD163 mRNA的表达诊断颅内动脉瘤的AUC为0.759（95% CI：0.618~0.890， P=0.002）。血浆中CD163蛋白含量诊断颅内动脉瘤的AUC为0.864（95% CI：0.610~1.000， P=0.035）。 结论:颅内动脉瘤组织及患者血液中 CD163 mRNA、患者血浆中CD163蛋白的表达较高。血液中 CD163 mRNA的表达是颅内动脉瘤发生的独立危险因素，血浆中CD163蛋白可作为筛选颅内动脉瘤的分子标记物。

目的:探讨严重烧伤小鼠肠-胰岛轴功能的变化及其作用。方法:该研究为实验研究。将90只雄性8~10周龄C57BL/6J小鼠按随机数字表法分为假伤组和烧伤组（每组45只小鼠），于烧伤组小鼠背部制备30%体表总面积Ⅲ度烫伤（以下称烧伤）创面，假伤组小鼠模拟致假伤。伤后24 h，检测空腹血糖（样本数为12）后，行腹腔糖耐量实验和口服糖耐量实验，并绘制血糖浓度-时间变化曲线，计算曲线下面积（样本数为6）；分别于腹腔注射或灌胃给予葡萄糖溶液前及腹腔注射或灌胃给予葡萄糖溶液后30、60、120 min从心脏取血，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测血浆胰岛素和胰高血糖素样肽1（GLP-1）水平（样本数为3）；取每组3只小鼠回肠组织，行免疫荧光染色及原位末端标记染色检测肠道L细胞GLP-1表达及凋亡水平；提取每组6只小鼠胰岛行葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验，分别经低糖（2.8 mmol/L葡萄糖）和高糖（16.7 mmol/L葡萄糖）孵育后取上清液，采用ELISA法检测胰岛素水平。取36只雄性8~10周龄C57BL/6J小鼠，按随机数字表法分为假伤组、烧伤组和烧伤+艾塞那肽4（Ex-4）组（每组12只小鼠），对假伤组和烧伤组小鼠行同前对应处理，将烧伤+Ex-4组小鼠同烧伤组小鼠致伤后给予其GLP-1受体激动剂Ex-4。伤后24 h，提取小鼠胰岛，采用蛋白质印迹法检测重链结合蛋白（BIP）、蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）、磷酸化PERK（p-PERK）、真核翻译起始因子2α（eIF2α）、磷酸化eIF2α（p-eIF2α）和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）的蛋白表达并计算p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α比值（样本数为3），采用流式细胞术检测胰岛细胞凋亡率（样本数为3），同前行葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验以检测上清液中胰岛素水平（样本数为6）。结果:伤后24 h，烧伤组小鼠空腹血糖为（7.3±1.0）mmol/L，显著高于假伤组的（5.1±0.6）mmol/L（ t=6.36， P<0.05）。伤后24 h，在腹腔糖耐量实验和口服糖耐量实验中，烧伤组小鼠血糖浓度-时间变化曲线下面积均显著大于假伤组（ t值分别为4.32、6.03， P<0.05）；与假伤组相比，烧伤组小鼠经腹腔注射给予葡萄糖溶液前血浆胰岛素水平及经腹腔注射或灌胃给予葡萄糖溶液前血浆GLP-1水平均显著降低（ P<0.05），经腹腔注射或灌胃给予葡萄糖溶液后30、60、120 min血浆胰岛素水平及经灌胃给予葡萄糖溶液后30、60 min血浆GLP-1水平均显著降低（ P<0.05）。伤后24 h，与假伤组相比，烧伤组小鼠肠道L细胞GLP-1表达水平显著降低（ t=7.74， P<0.05），凋亡水平显著升高（ t=14.28， P<0.05）。伤后24 h，烧伤组小鼠经高糖孵育的胰岛上清液中胰岛素水平为（8.5±0.4）ng/mg，显著低于假伤组的（15.7±0.3）ng/mg（ t=18.68， P<0.05）。伤后24 h，与假伤组相比，烧伤组小鼠胰岛中BIP、p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α和CHOP的蛋白表达水平均显著升高（ P<0.05）；与烧伤组相比，烧伤+Ex-4组小鼠胰岛中BIP、p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α和CHOP的蛋白表达水平均显著降低（ P<0.05）。伤后24 h，烧伤组小鼠胰岛细胞凋亡率为（32.0±3.0）%，显著高于假伤组的（10.3±2.5）%（ P<0.05）；烧伤+Ex-4组小鼠胰岛细胞凋亡率为（20.0±3.6）%，显著低于烧伤组（ P<0.05）。伤后24 h，烧伤组小鼠经高糖孵育的胰岛上清液中胰岛素水平显著低于假伤组（ P<0.05），烧伤+Ex-4组小鼠经高糖孵育的胰岛上清液中胰岛素水平显著高于烧伤组（ P<0.05）。 结论:严重烧伤后小鼠肠-胰岛轴功能障碍，肠道L细胞凋亡增多、GLP-1合成及分泌减少，胰岛细胞发生内质网应激、凋亡增多，葡萄糖刺激的胰岛素分泌减少；GLP-1受体激动剂Ex-4能保护严重烧伤小鼠胰岛细胞功能，可能通过减轻内质网应激降低胰岛细胞凋亡水平，促进胰岛素分泌。

目的:观察大鼠多系分化持续应激(Muse)细胞对肠上皮细胞间紧密连接结构的保护作用。方法:贴壁筛选法自大鼠(6只，购自中国食品药品检定院)股骨内分离大骨髓间充质干细胞(BMMSCs)，长时间胰蛋白酶孵育法(LTi)自BMMSCs中分离大鼠Muse细胞，流式细胞术标记如白细胞分化抗原(CD)29、CD34、CD90等及特异阶段胚胎抗原-3(SSEA-3)抗体；免疫组织化学法标记Nanog同框蛋白(NANOG)等抗体，定向诱导分化后标记α-甲胎蛋白(AFP)等鉴定其多能分化能力；重组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)建立体外肠上皮细胞损伤损伤模型；与Muse细胞共培养后检测细胞增殖能力及桥接蛋白-1(ZO-1)的表达水平及形态，组间比较采用 t检验。 结果:LTi后，大鼠BMMSCs中(2.57±0.57)%能够形成特征性的Muse细胞簇；流式细胞术结果表明，Muse细胞保留了BMMSCs表面分子特征，SSEA-3的阳性细胞比例[(73.2±1.4)%]显著高于BMMSCs[(2.3±0.3)%]；免疫荧光实验表明，培养的Muse细胞阳性表达NANOG等多能分化标记，定向诱导分化后分别能够表达AFP等分化标记；Muse细胞与TNF-α炎症损伤的肠上皮细胞共培养后，其增殖细胞比例[(40.06±1.04)%]高于损伤[(23.10±2.05)%]组的细胞( t＝12.79， P<0.05)及ZO-1蛋白的相对表达水平(0.55±0.03、0.27±0.01， t＝13.03， P<0.05)。 结论:大鼠Muse细胞具有更加理想的保护炎症损伤肠上皮细胞紧密连接结构的作用。

目的:观察对比神经干细胞（NSC）在Matrigel水凝胶培养和悬浮培养的神经干细胞的生长形态、增殖、分化潜能、细胞产量及存活率等情况。方法:分离提取孕12~13 d胎鼠大脑组织中的神经干细胞，用悬浮培养、三维Matrigel水凝胶支架培养2种培养方案传代神经干细胞，分别进行形态学观察分析，免疫组织化学荧光术鉴定巢蛋白（Nestin）和Sox-2的表达，及流式细胞术鉴定免疫表型；用10%的胎牛血清诱导分化培养基诱导神经干细胞分化后，行免疫荧光染色鉴定神经干细胞的终末分化细胞：神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞，对应特异性标记物分别为NeuN、CNPase、GFAP。结果:免疫荧光鉴定P1代NSC，Nestin和Sox-2双阳性表达；P2代流式细胞鉴定Nestin∶90%，证明从胎鼠大脑能够获取纯度较高的神经干细胞；台盼蓝染色计数表明Matrigel基质胶三维培养方案细胞产量明显升高，是悬浮培养方案的5~10倍，收取的神经干细胞的存活率较悬浮培养稍增高，但无统计学差异意义（ P=0.0812）。本试验两种方法培养的NSC均具多向分化性能，均能分化成神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞，分化后各终末细胞所占比例基本一致（ P值分别为：0.1302；0.1108；0.1605）。 结论:相比于悬浮培养，三维Matrigel水凝胶支架方案培养出的NSC，具有活性高，增殖能力强，消化后死亡率低，细胞产量大，能达到悬浮培养的5倍以上，能稳定传代及便于细胞形态学观察等优点，并在连续传至多代后仍能保持NSC的基本特性和多向分化潜能。

目的:构建表达报告基因荧光素酶和肿瘤相关抗原间皮素(mesothelin，MSLN)基因的胰腺癌细胞系，评估其作为靶细胞在评价免疫细胞的肿瘤杀伤效力中的应用。方法:构建表达荧光素酶、MSLN基因的慢病毒载体，包装慢病毒，感染胰腺癌细胞系，抗生素筛选后，有限稀释法获得单细胞克隆，并验证目的基因的稳定表达。实时无标记细胞分析(real-time cell analysis，RTCA)和荧光素酶活性检测方法体外检测免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效力。将构建的细胞系接种B-NDG小鼠建立表达荧光素酶的胰腺癌肿瘤模型，利用活体成像技术检测荧光素酶表达水平，监测小鼠体内胰腺癌肿瘤生长情况。在胰腺癌小鼠模型中验证嵌合抗原受体T(chimeric antigen receptor T，CAR-T)细胞的肿瘤杀伤能力。结果:本研究建立了稳定表达荧光素酶和MSLN基因的胰腺癌细胞系panc-1-luc、panc-1-luc-MSLN和capan-2-luc细胞。3种细胞的报告基因表达水平较高，与细胞数量呈正相关，panc-1-luc-MSLN细胞的MSLN阳性率达95.6%。体外肿瘤细胞杀伤试验结果表明MSLN-CAR-T细胞能特异性杀伤MSLN抗原阳性的panc-1-luc-MSLN细胞和capan-2-luc细胞，最小杀伤率分别为(70.00±18.19)%和(57.00±5.29)%，而对MSLN阴性的panc-1-luc细胞无杀伤作用。RTCA结果显示MSLN-CAR-T细胞对构建的3种胰腺癌细胞均有杀伤能力，最小杀伤率分别为(56.33±7.64)%、(93.00±2.65)%和(26.33±28.15)%；NK-92MI细胞对靶细胞的杀伤不受MSLN限制。免疫缺陷小鼠胰腺癌模型结果显示，体内杀伤效力与体外荧光素酶活性检测结果一致。体内外试验证明，检测靶细胞荧光素酶表达活性，可以反映免疫细胞对靶细胞的杀伤效力。结论:本研究建立了稳定表达荧光素酶的多株胰腺癌单克隆细胞系，可用于体内外免疫治疗产品肿瘤杀伤效力的研究评价。