目的:探讨Krüppel样因子4（KLF4）在巨噬细胞炎症反应中的表达特点与作用及其对脓毒症小鼠炎症反应与脏器损伤的作用，为烧创伤脓毒症的靶向治疗奠定理论基础。方法:采用实验研究方法。取小鼠RAW264.7巨噬细胞与从10只6~8周龄雄性C57BL/6J小鼠中提取的原代腹腔巨噬细胞（PM）进行实验。采用内毒素/脂多糖（LPS）分别处理RAW264.7巨噬细胞与PM 0（未处理）、1、2、4、6、8、12、24 h构建巨噬细胞炎症反应模型，采用实时荧光定量反转录PCR（RT-PCR）法检测白细胞介素1β（IL-1β）、IL-6、CC趋化因子配体2（CCL2）与肿瘤坏死因子α（TNF-α）mRNA表达，据此确定后续部分实验LPS处理时间。用LPS处理RAW264.7巨噬细胞0、8 h，采用免疫荧光法检测KLF4的定位与蛋白表达；利用高通量测序技术平台对细胞进行转录组测序，采用DESeq2软件筛选2种处理时间细胞间的差异表达基因（DEG）。采用LPS分别处理RAW264.7巨噬细胞与PM 0、1、2、4、6、8、12、24 h，分别用实时荧光定量RT-PCR法与蛋白质印迹法检测KLF4的mRNA与蛋白表达。将RAW264.7巨噬细胞按随机数字表法分为阴性对照组与KLF4过表达组，分别转染对应质粒后用LPS处理0、8 h，采用实时荧光定量RT-PCR法检测KLF4、IL-1β、IL-6、CCL2与TNF-α的mRNA表达，采用蛋白质印迹法检测KLF4蛋白表达。前述实验样本数均为3。将40只6~8周龄雄性C57BL/6J小鼠按随机数字表法分为KLF4过表达组和阴性对照组（每组20只），分别注射相应转染注射液后构建盲肠结扎穿孔脓毒症模型。采用随机数字表法从2组小鼠中各选取12只，观察建模后72 h内生存情况。于建模后8 h取2组分别剩余的8只小鼠，先行眼球取血，采用酶联免疫吸附测定法检测血清中IL-1β、IL-6水平，采用干化学法检测血清中丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）水平；后取心脏、肺脏、肝脏组织，行苏木精-伊红染色后观察损伤情况。对数据行独立样本 t检验、Cochran&Cox近似 t检验、单因素方差分析、Dunnett检验、Brown-Forsythe和Welch单因素方差分析、Dunnett T3检验、log-rank（Mantel-Cox）检验。 结果:与LPS处理0 h比较，LPS处理6 h与8 h RAW264.7巨噬细胞中IL-1β mRNA表达、LPS处理4~12 h RAW264.7巨噬细胞中IL-6 mRNA表达、LPS处理8 h和12 h RAW264.7巨噬细胞中CCL2 mRNA表达以及LPS处理4~8 h RAW264.7巨噬细胞中TNF-α mRNA表达均显著上调（ P<0.05或 P<0.01），LPS处理4~8 h PM中IL-1β与CCL2 mRNA表达、LPS处理2~24 h PM中IL-6 mRNA表达以及LPS处理2~12 h PM中TNF-α mRNA表达均显著上调（ P<0.05或 P<0.01）。选取8 h作为后续部分实验的LPS处理时间。KLF4主要定位在RAW264.7巨噬细胞的细胞核中。与LPS处理0 h比较，LPS处理8 h RAW264.7巨噬细胞中KLF4蛋白表达明显减少；LPS处理8 h RAW264.7巨噬细胞中有1 470个差异表达显著的DEG，包括转录表达显著下调的 KLF4［错误发现率<0.05，log 2（差异倍数）=-2.47］。与LPS处理0 h比较，LPS处理6~24 h RAW264.7巨噬细胞中KLF4 mRNA表达、LPS处理1~24 h RAW264.7巨噬细胞与PM中KLF4蛋白表达以及LPS处理4~24 h PM中KLF4的mRNA表达均明显降低（ P<0.05或 P<0.01）。与阴性对照组比较，KLF4过表达组LPS处理0、8 h RAW264.7巨噬细胞中KLF4的mRNA（ t'值分别为17.03、8.61， P<0.05或 P<0.01）与蛋白表达均明显升高，LPS处理0 h RAW264.7巨噬细胞中IL-6、CCL2的mRNA表达均明显升高（ t值分别为6.29、3.40， P<0.05或 P<0.01），LPS处理8 h RAW264.7巨噬细胞中IL-1β、IL-6、CCL2、TNF-α的mRNA表达均显著下降（ t值分别为10.52、9.60、4.58、8.58， P<0.01）。KLF4过表达组小鼠建模后72 h内生存比例明显高于阴性对照组（ χ2=4.01， P<0.05）。建模后8 h，KLF4过表达组小鼠血清中IL-1β、IL-6与ALT、AST水平分别为（161±63）、（476±161）pg/mL与（144±24）、（264±93）U/L，明显低于阴性对照组的（257±58）、（654±129）pg/mL与（196±27）、（407±84）U/L（ t值分别为3.16、2.44与4.04、3.24， P<0.05或 P<0.01）。建模后8 h，与阴性对照组比较，KLF4过表达组小鼠心脏、肺脏、肝脏的组织结构紊乱减轻，炎性渗出明显减少，脏器实质细胞病理样改变明显减轻。 结论:KLF4在LPS诱导的巨噬细胞炎症反应中表达显著下降，显著抑制巨噬细胞炎症反应；KLF4显著提高脓毒症小鼠生存率并缓解炎症反应与脓毒症相关脏器损伤。

目的:分析老年肺隐球菌病的临床特点、影像学表现和诊治情况，为临床早期诊断和治疗提供依据。方法:回顾性分析浙江大学医学院附属第一医院2015年1月至2020年9月确诊的42例老年肺隐球菌病患者的临床资料，同时利用SPSS软件比较其在免疫低下患者与免疫正常患者间的差异。结果:患者平均(66.0±5.3)岁，免疫低下者27例，常见基础疾病为风湿免疫性疾病、肿瘤、慢性肾病，主要临床表现是咳嗽、咳痰、发热及胸闷。22例肺部CT表现为结节肿块型，以多发结节为主。24例发生于单侧肺，主要分布于下叶。免疫低下组与免疫正常组在临床表现、病灶类型和分布位置上差异无统计学意义(均 P>0.05)，支气管充气征的发生率在免疫正常组中高于免疫低下组( P<0.05)。17例经病理确诊，25例经荚膜多糖抗原检测阳性临床确诊。手术治疗9例，1例术后临床观察，8例术后氟康唑治疗。33例采用抗真菌治疗，其中6例行药物联合治疗。8例失访，治愈或好转29例，进展2例，死亡3例。 结论:老年肺隐球菌病在免疫低下患者中更多见，临床症状不典型，误诊率高，隐球菌荚膜多糖抗原检测有助于早期诊断，需根据患者免疫状态和个体情况，选择和调整治疗方案。

目的:利用生物信息学分析筛选脓毒症心脏组织巨噬细胞差异表达基因（DEGs）并对关键基因进行验证。方法:实验1（基因芯片与生物信息学分析）：从基因表达数据库（GEO）下载脓毒症小鼠心脏巨噬细胞基因芯片数据GSE104342，通过R语言分析获得DEGs，使用DAVID在线数据库对DEGs进行基因本体及功能注释和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，最后利用基因与蛋白质相互作用检索数据库（STRING）对DEGs进行基因编码蛋白质-蛋白质相互作用分析，并运用Cytoscape软件及MCODE等插件筛选出关键基因。实验2（脓毒症模型构建与相关基因验证）：8~14周龄雄性C57BL/6小鼠10只，随机选取5只作为对照组，5只在体构建小鼠脓毒症模型作为脓毒症组。超声心动图检测小鼠心脏功能，采用苏木精-伊红染色法检测小鼠心脏形态，原位缺口末端标记法检测小鼠心肌细胞凋亡，免疫荧光染色检测分化抗原簇206（CD206）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、F4/80、细胞因子信号转导抑制因子3（Socs3）、白细胞介素1受体拮抗剂（Il1rn）和CC趋化因子7（Ccl7）蛋白表达。体外培养RAW264.7巨噬细胞，分为2组：（1）脂多糖刺激组：给予1 mg/L脂多糖干预；（2）空白对照组：加入等体积磷酸缓冲液溶液。采用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应检测巨噬细胞Socs3、Il1rn和 Ccl7基因表达。结果:实验1：GSE104342数据集筛选出24 647个基因，DEGs共177个（0.72%），其中上调基因120个，下调基因57个。基因本体富集分析表明，DEGs主要参与炎症反应、免疫应答、凋亡调控和抗原加工提呈等过程。KEGG信号通路分析发现，脓毒症小鼠心脏巨噬细胞中DEGs主要富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、肿瘤坏死因子信号通路、NOD样受体信号通路等。STRING及Cytoscape分析构建基因相互作用网络图及重要子模块，获得了3个hub基因，分别为Socs3、Il1rn和Ccl7。实验2：在体实验发现，与对照组相比，脓毒症组小鼠心脏功能明显下降，心肌细胞明显水肿、炎性细胞浸润、心肌纤维断裂，部分心肌细胞核溶解消失，心肌细胞凋亡增加，提示小鼠脓毒症心肌损伤模型构建成功。与对照组相比，脓毒症组小鼠心脏中CD206蛋白表达下调，iNOS、F4/80、Socs3、Il1rn和Ccl7蛋白表达上调，且Socs3、Il1rn、Ccl7与F4/80蛋白存在共定位。体外实验发现，与空白对照组相比，脂多糖刺激巨噬细胞后Socs3、Il1rn和Ccl7水平明显上调。结论:脓毒症小鼠心脏中巨噬细胞Socs3、Il1rn和Ccl7基因表达上调，Socs3、Il1rn和Ccl7有望成为诊治脓毒症心脏损伤的新靶点。

目的:研究A组P[15]型轮状病毒VP8*蛋白的多糖结合特异性。方法:利用大肠杆菌表达系统制备A组P[15]型牛轮状病毒毒株的VP8*蛋白，通过寡糖结合实验、生物膜层干涉实验及血凝等方法研究其与不同糖的结合。结果:A组P[15]型牛轮状病毒VP8*蛋白结合Neu5Ac和Neu5Gc唾液酸，与α2, 3和α2, 6方式连接的唾液酸糖也有较好的结合。此外，P[15] VP8*蛋白可以凝集人和动物的红细胞。结论:唾液酸可能是A组P[15]型轮状病毒的糖受体。与猴P[3]、猪P[7]轮状病毒相似，牛P[15]VP8*蛋白与唾液酸结合，并且序列和结构分析显示它们具有相同的糖结合位点。

目的:寻找内毒素耐受（ET）的潜在关键基因，为脓毒症的治疗提供理论和实验依据。方法:①实验1（基因芯片与生物信息分析）：从基因表达数据库（GEO）中下载ET相关基因数据集GSE47783，该数据集由脂多糖（LPS）刺激小鼠巨噬细胞建立脓毒症模型（LPS组）和ET模型（ET组）后进行实验获得；利用IDEP 0.92软件筛选数据集中两组差异表达基因（DEG），同时进行基因本体（GO）分析，并定位DEG主要富集的功能和信号通路。利用基因与蛋白质相互作用检索数据库（STRING），针对DEG构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，筛选出核心基因甲型肝炎病毒细胞膜蛋白受体2（HAVCR2）进行后续验证研究。②实验2（小鼠巨噬细胞株RAW264.7模型制备）：体外培养RAW264.7细胞，通过LPS刺激制备ET模型（ET组，用10 μg/L的LPS培养24 h后，再用100 μg/L的LPS培养4 h）和脓毒症模型（LPS组，用100 μg/L的LPS培养4 h）；磷酸盐缓冲液（PBS）组给予等体积溶媒PBS培养4 h。采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）检测细胞HAVCR2的mRNA及蛋白表达。③实验3（HAVCR2慢病毒载体转染RAW264.7细胞）：为进一步明确HAVCR2是否参与ET形成，用慢病毒短发夹RNA（shRNA）技术敲低RAW264.7细胞中的HAVCR2后，再制备ET模型（HAVCR2 --ET组），并设非敲低HAVCR2的对照组（ET组）。采用RT-qPCR法检测细胞中巨噬细胞极化关键基因〔精氨酸酶1（ARG1）、CD206、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、一氧化氮合酶2（NOS2）〕的mRNA表达。 结果:①实验1：共获得1 013个DEG；与LPS组比较，ET组有521个上调基因，492个下调基因；这些DEG的功能主要为增加生物合成、抑制炎症反应，主要富集于Janus激酶/信号转导与转录激活因子（JAK/STAT）、NOD样受体、Toll样受体（TLR）、TNF、缺氧诱导因子-1（HIF-1）等信号通路。选择ET组第一个表达上调的膜蛋白HAVCR2作为验证研究的目标。②实验2：体外实验结果显示，经大剂量LPS处理后，RAW264.7细胞中HAVCR2 mRNA表达较PBS组明显下调；而ET组HAVCR2 mRNA表达明显高于LPS组（2 -ΔΔCT：1.10±0.10比0.60±0.10， P<0.05）；Western blotting检测结果与RT-qPCR结果一致。③实验3：与ET组相比，HAVCR2 --ET组细胞ARG1和CD206的mRMA表达明显降低〔ARG1 mRNA（2 -ΔΔCT）：0.50±0.10比1.00±0.10，CD206 mRNA（2 -ΔΔCT）：0.73±0.10比1.00±0.10〕，下游因子TNF-α和IL-1β的mRNA表达明显升高〔TNF-α mRNA（2 -ΔΔCT）：2.20±0.10比1.00±0.10，IL-1β mRNA（2 -ΔΔCT）：9.00±0.10比1.00±0.10〕，差异均有统计学意义（均 P<0.05）；两组NOS2 mRNA表达差异无统计学意义。 结论:HAVCR2参与脓毒症下游炎性因子的调节，参与ET的形成，有望成为脓毒症新的治疗靶点。

目的:通过生物信息学方法探索与白癜风进展相关的信号通路和基因。方法:从GEO数据库中下载白癜风芯片检测数据集GSE75819，利用R语言软件中limma包的LMFit和eBayes函数筛选15例印度白癜风患者皮损与非皮损组织间的差异表达基因（DEG）。通过京都基因与基因组数据库（KEGG）、基因本体论（GO）分析和基因集富集分析（GSEA）评估DEG的富集途径和功能。通过蛋白-蛋白相互作用网络从DEG中筛选中心基因。2019年1 - 6月于新疆维吾尔自治区维吾尔医医院收集8例汉族寻常型白癜风患者皮损及非皮损皮肤组织标本，采用实时定量PCR法验证上述上调及下调差异最大的10个DEG的表达。结果:与15例非皮损组织相比，在15例白癜风皮损组织中共发现148个DEG，其中KRT9、CXCL10、C8ORF59、TPSAB1、RPL26为前5位上调基因，SILV、RPPH1、TYRP1、MLANA、LOC401115为前5位下调基因，且经实时定量PCR在8例汉族白癜风患者皮损及非皮损组织中验证。GO分析显示，DEG主要富集于翻译起始、细胞对脂多糖的反应、核糖体、核糖体亚基和核糖体的结构组成等。KEGG通路分析显示，DEG主要富集于酪氨酸代谢、PPAR信号通路、氧化磷酸化和Toll样受体信号通路。蛋白-蛋白相互作用分析筛选出UPF3B、SNRPG、MRPL13和RPL26L1 4个中心基因。结论:KRT9、CXCL10、C8ORF59、TPSAB1、RPL26、SILV、RPPH1、TYRP1、MLANA及LOC401115可能作为白癜风潜在的诊断标记分子和治疗靶点。

目的:研制新型非天然氨基酸标记的HiD-Hin47融合载体蛋白。方法:选择融合蛋白氨基酸序列中合适位置的20个氨基酸位点，利用非天然氨基酸标记技术将原有氨基酸位置插入一种含叠氮基的非天然氨基酸N6-(2-叠氮乙氧羰基)-L-赖氨酸(NAEK)，对不同位点插入NAEK的融合蛋白进行表达和纯化，纯化后产物经SDS-PAGE分析，观察各位点融合蛋白产量，最终E677位点表达稳定性更高，均能达到野生型的70%，选择E677位点表达的融合蛋白与3型和6B型肺炎球菌多糖发生click反应完成偶联，所得结合物纯化后进行动物实验和免疫学检测，并与CRM197、破伤风类毒素(TT)、HiD以常规结合方式与3型和6B型肺炎球菌多糖结合产物进行对比。结果:以HiD-Hin47为载体蛋白的3型肺炎球菌多糖结合物的免疫原性稍优于与其余3组结合物，但差异无统计学意义；以HiD-Hin47为载体蛋白的6B型肺炎球菌多糖结合物的免疫原性显著优于以TT、HiD为载体的结合物，与以CRM197为载体结合物的免疫原性差异无统计学意义。结论:NAEK标记的HiD-Hin47具有作为肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗载体蛋白的潜力，值得进行进一步研究。

目的:探讨核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)/转录因子GATA结合蛋白4(GATA-4)/血管内皮生长因子(VEGF)信号通路在新生血管性年龄相关性黄斑变性(nAMD)中的作用。方法:利用TRANSFAC转录因子数据库搜索人源和鼠源VEGF启动子及其上游序列，分析可能影响VEGF转录活性的转录因子。将小鼠巨噬细胞RAW264.7分为对照组和脂多糖(LPS)刺激组，qRT-PCR检测LPS对NLRP3炎症小体活化、GATA-4和血管内皮生长因子A(VEGFA)mRNA表达的影响；应用特异性NLRP3小分子抑制剂MCC950预处理RAW264.7细胞(LPS+MCC950组)，检测NLRP3、Caspase-1、IL-1β、GATA-4和VEGFA基因表达水平的变化。结果:人源和鼠源VEGF启动子上游均存在多个GATA转录因子结合位点。与对照组比较，LPS组NLRP3、Caspase-1、IL-1β、GATA-4和VEGFA mRNA表达增加(均 P<0.05)；与LPS刺激组比较，LPS+MCC950组NLRP3、Caspase-1、IL-1β、GATA-4和VEGFA mRNA水平均明显降低(均 P<0.05)。 结论:NLRP3/GATA-4/VEGF信号通路可能在nAMD的病理过程中发挥重要调节作用。

目的:探讨耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)脂多糖修饰相关的多黏菌素耐药机制。方法:通过接合转移和 mcr基因的检测探究是否存在质粒介导的耐药基因；利用实时荧光定量PCR检测多黏菌素耐药相关基因的相对表达量，并进行全基因组测序分析；采用SDS-PAGE银染试验和MALDI-TOF-MS质谱分析检测脂多糖的改变。 结果:未扩增出 mcr-1~8基因且接合转移试验结果为阴性，未检测到与耐药性相关的可移动元件。7株多黏菌素耐药CRKP中 pmrA、 pmrB、 pmrC基因的相对表达量均增高，其中6株 phoP/ phoQ基因的相对表达量增高；3株 crrA/ crrB基因的相对表达量降低；4株 mgrB基因的相对表达量降低。耐药株发生的错义突变位点主要位于 KPHS_09430、 KPHS_35900、 KPHS_39520、 KPHS_52420等基因上，在CRKP-6菌株中检测到IS Kpn14插入序列。MALDI-TOF-MS观察到耐药菌株脂多糖中天然脂质A有L-Ara4N修饰。 结论:染色体介导的双组分调节系统突变引起脂多糖修饰是本研究CRKP对多黏菌素耐药的主要机制，且双组分调节系统的突变对多黏菌素耐药性的影响在不同菌株背景下也存在差异。

目的:探讨线粒体融合蛋白1(mitofusin 1，MFN1)对脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的小鼠Raw264.7巨噬细胞焦亡的调控作用，为预防巨噬细胞功能障碍导致的炎症和纤维化提供新的研究靶点和理论参考。方法:体外培养小鼠单核巨噬细胞Raw264.7，构建LPS诱导的细胞焦亡模型。CCK-8、PI染色、LDH释放、Western blot等验证LPS诱导Raw264.7细胞发生焦亡；Western blot筛选异常表达的线粒体相关蛋白MFN1；DCFH-DA探针检测细胞总活性氧生成情况、Mito-SOX探针检测线粒体活性氧水平、JC-1线粒体膜电位荧光探针检测线粒体膜电位变化以反映线粒体受损情况；利用Ubibrowser数据库预测出MFN1蛋白可与多种E3泛素连接酶结合，通过免疫荧光、免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，CO-IP)试验等验证MFN1蛋白是否受泛素化调控；采用Lipofectamine2000试剂转染MFN1过表达质粒检测MFN1蛋白对细胞焦亡和线粒体功能的影响。结果:LPS诱导Raw264.7细胞发生线粒体功能障碍和焦亡。LPS刺激后MFN1蛋白表达减少。CO-IP试验证明MFN1蛋白发生泛素化修饰。泛素化抑制剂MG-132处理后抑制LPS诱导的细胞焦亡相关蛋白NLRP3、Pro-caspase-1、Caspase-1、IL-1β、IL-18表达上调并且改善线粒体功能。MFN1过表达后缓解LPS导致的线粒体稳态失衡和巨噬细胞焦亡。结论:LPS通过影响MFN1泛素化修饰调节线粒体功能障碍，进而导致巨噬细胞焦亡，本研究为治疗巨噬细胞诱导的炎症及相关疾病提供了潜在靶点。