在突发公共卫生事件中，医务人员的负面情绪和心理问题普遍存在，需要心理支援与社会支持。为探索常态情况下的医院资源整合联动机制以及对院内员工的心理关怀和社会支持评估方法、团队合作形式、工作流程、服务内容、技术手段等，作者以新型冠状病毒肺炎疫情为例，探索突发公共卫生事件下的员工关怀与支持应急体系。复旦大学附属儿科医院作为新冠疫情防治定点医院，在党委领导下成立由工会、社工部、心理科等多部门参与的员工心理关怀与支持小组，并在以往员工服务基础上加入创新服务项目。在抗击新冠疫情期间，员工心理关怀与支持小组对院内员工开展心理、物资、信息、社会支持等方面的需求评估。根据评估结果，结合突发公共卫生事件特点，开展针对员工及家属的系列关怀与支持服务。最终，形成多部门、多学科分级合作的常态化员工关怀与支持服务流程。同时，在常态化流程的基础上，结合抗疫期间员工服务实践经验，总结出突发公共卫生事件下的医务人员关怀与支持体系，包括常态化预案的重点内容、突发公共卫生事件发生时对医务人员的需求评估内容与形式、突发公共卫生事件下对员工开展需求评估的时机与服务介入的时机、突发公共卫生事件下员工关怀与支持的重点服务内容等。

目的:通过梳理和总结定点医院在新型冠状病毒肺炎疫情防控下的科研管理应对策略和实践，为国内同类型医院突发公共卫生事件科技攻关管理提供参考。方法:以2020年新型冠状病毒肺炎疫情防控下的医院科研管理应对为例，从管理体系、制度建设、资源整合、项目运行及科管服务等方面探讨和总结定点医院在以新发突发传染病为代表的突发公共卫生事件防控科技攻关管理中的应对策略、工作实践和存在的问题。结果:作为北京市新型冠状病毒肺炎定点医院，北京佑安医院在出色完成患者救治工作的同时，积极开展疫情防控科技攻关工作，建立了科学高效的科技攻关管理体系，整合资源形成了高效的攻关项目运行机制，提供全方位科管服务，为快速高质完成疫情防控科技攻关提供了政策和物质保障。结论:突发公共卫生事件科技攻关具有需求牵引、突出重点、协作攻关及科学决策等特色，为顺利开展应急科技攻关工作，结合单位自身特点和现状形成良性互动，理顺体制机制，做好长远规划布局，建立科学高效的科技攻关和管理机制尤为重要。

目的:人外周血淋巴细胞株8E5可分泌无感染性HIV-1病毒颗粒，靶向于8E5细胞株基因组整合的HIV-1前病毒基因POL区，基于CRISPR/Cas9点突变技术构建含有POL区耐药突变位点的单克隆细胞株，可用于制备一种安全稳定的新型HIV-1基因型耐药检测质控品。方法:设计构建小向导RNA(single guide RNA，sgRNA)和Cas9共表达载体以及携带有目标突变位点的供体单链寡核苷酸(donor single-stranded oligonucleotides，Donor ssODN)共转染8E5细胞，通过流式微孔板分选获得转染成功的阳性单克隆细胞株，通过Sanger测序确认定点突变的编辑效果。对定点突变编辑成功的单克隆细胞株培养至第3代、5代和7代的细胞及细胞分泌到上清中的HIV病毒颗粒进行Sanger测序，验证定点突变的编辑效果。结果:成功构建双sgRNA和Cas9共表达载体，与携带有耐药突变位点Q151M的Donor ssODN共转染8E5细胞株的效果良好。对分选获得的共转染阳性单克隆细胞株进行靶位点测序，结果显示成功构建了携带有定点突变Q151M的纯合子单克隆细胞株8E5 Q151M。细胞株8E5 Q151M多次传代后的细胞及细胞分泌的无感染性HIV-1病毒颗粒可被持续检测出Q151M突变位点。 结论:利用CRISPR/Cas9点突变技术成功构建稳定携带有Q151M耐药突变位点的细胞株8E5 Q151M，为制备HIV-1基因型耐药检测质控品提供新的技术平台。

目的:利用CRISPR/Cas9技术构建POLQ基因敲除293T细胞系,并探讨该敲除细胞系在外源基因定点整合方面的应用.方法:构建靶向POLQ基因的pX330-sgRNA打靶载体,通过T7EI酶切验证,选取打靶效率最高的载体,转染293T细胞;利用流式细胞分选术、稳定单细胞克隆培养、TA克隆测序及蛋白质印迹等方法验证POLQ敲除情况;利用靶向AAVS1和FBL位点的含GFP/mCherry报告基因同源打靶载体,评估敲除的293T POLQ-/-细胞系在外源基因定点整合效率的变化,并通过测序方式验证供体报告载体是否定点整合到基因组中;最后分析POLQ敲除对293T细胞增殖和存活率的影响.结果:成功在293T细胞中稳定敲除POLQ基因;通过报告基因实验验证,敲除细胞系中外源基因定点整合效率平均提高2～7倍,且敲除POLQ基因对293T细胞系增殖和存活率没有明显影响.结论:成功利用CRISPR/Cas9技术构建具有高效定点整合能力的POLQ基因稳定敲除293T细胞系,为进一步利用该细胞系高效制备稳定整合外源基因(包括抗体基因)工程化细胞系奠定基础.

目的 利用规律成簇的间隔排列的短回文重复序列及其核酸酶9(CRISPR/Cas9)基因编辑技术构建靶向识别Her2的B细胞,探究基因编辑B细胞的抗肿瘤免疫治疗作用.方法 设计针对B细胞抗原受体(BCR)的sgRNA并克隆至lentiCRISPR v2载体上,经重组T7核酸内切酶I(T7E1)酶切实验验证sgRNA的切割效率.通过分子克隆技术从曲妥珠单抗基因中调取scFv序列并和同源臂连接在一起,构建到cppt-IRES-GFP慢病毒载体中作为同源重组模板.分别将Cas9/sgRNA表达质粒和同源模板质粒与BaEVTR包膜质粒、psPAX2-D64V骨架质粒包装成整合酶缺陷的慢病毒(IDLV),用2种慢病毒同时感染人原代B细胞进行基因编辑.将基因编辑的B细胞与Her2阳性肿瘤细胞SKBR-3共培养,通过流式检测B细胞的活化和增殖.用293T-CD40L-sBAFF饲养细胞扩增基因编辑的B细胞.从临床生物样本库获取Her2阳性乳腺癌标本构建患者来源的肿瘤类器官模型,评估基因编辑B细胞浸润、清除肿瘤的能力.结果 选择IGHD作为打靶位点、切割率最高的sgRNA(约为52％)作为最终的打靶序列.2种IDLV同时感染B细胞后,scFv整合效率明显提高,达到25％,差异有统计学意义(t=6.357,P＜0.001).对基因编辑的B细胞进行基因组PCR的结果显示,scFv基因定点敲入到了靶位点.流式检测基因编辑的B细胞能靶向识别SKBR-3,从而活化并增殖.靶向识别Her2的B细胞与293T-CD40L-sBAFF饲养细胞共培养能迅速大量扩增.Biotek活细胞实时荧光成像系统观测到靶向识别Her2的B细胞浸润、清除肿瘤类器官的能力显著增强.结论 本研究成功获得了大量靶向识别Her2的B细胞,在肿瘤类器官模型中靶向识别Her2的B细胞能有效浸润并清除肿瘤.

目的 构建基于ΦC31整合酶和载体质粒pUASTattB的果蝇转基因系统的阴性对照品系,为转基因果蝇研究实验提供更科学的阴性对照.方法 用显微注射法将载体质粒pUASTattB(可携带目的基因完成定点插入的常用载体质粒)转入携带ΦC31整合酶的4种不同遗传背景的果蝇品系attP-25C6、attP-68A4、attP-75B1和attP-86F8胚胎中,培养获得G0代成虫后将每只G0代成虫分别与平衡子果蝇品系ywR13S做单管杂交(每管中G0代成虫1只与ywR13S 3只进行杂交),通过观察G1代果蝇的复眼颜色,判断是否有mini-White插入,计算成功插入的概率.再选取成功插入mini-White的G1代果蝇成虫与3种平衡子果蝇品系DB、ywR13S和yw122分别做单管杂交(1只G1代雄果蝇与3只平衡子品系处女蝇杂交),平衡保种.提取保种好的果蝇品系基因组DNA,用PCR法鉴定载体质粒pUASTattB转入情况.结果 4种不同遗传背景的果蝇成功显微转入pUASTattB质粒后,再用3种平衡子果蝇品系进行平衡保种,得到 12株果蝇品系,均为携带mini-White标记的红眼果蝇,PCR鉴定表明有pUASTattB序列插入.结论 12株转基因果蝇品系可基本满足以pUASTattB为载体构建的转基因果蝇研究实验的阴性对照需求,丰富了国家果蝇资源中心的果蝇资源.

旨在构建人AAVS1位点定点敲入的诱导表达型ERK-SPARK激酶荧光探针的人食管鳞癌细胞株(KYSE-150).根据AAVS1 位点的DNA序列设计和已公开ERK-SPAEK荧光探针碱基序列构建了两端带有 750 bp同源臂的诱导型ERK-SPARK表达盒的同源重组供体质粒.其次,利用在线设计工具设计了 3 个靶向AAVS1位点的 sgRNA,并克隆至 pX330 骨架质粒中得到 3 个能定点切割AAVS1 位点的CRISPR/Cas9 打靶载体,将同源重组供体质粒分别与表达CRISPR/Cas9 打靶载体共转染KYSE-150 细胞,经Dox诱导表达 24 h后进行嘌呤霉素抗性筛选和流式细胞分选,得到抵抗嘌呤霉素且表达GFP的细胞亚群.再应用 PCR鉴定基因型,以及 Western blot 检测蛋白表达.对获得的细胞群提取基因组DNA并进行PCR基因型鉴定,结果显示获得片段的大小与诱导型ERK-SPARK表达盒的大小一致.蛋白表达检测结果显示,该细胞群表达了ERK-SPARK探针融合蛋白.荧光探针成像实验结果显示,在未经Dox诱导表达条件下,细胞株有极少量泄漏表达;经Dox诱导表达后,GFP荧光蛋白在细胞质内均匀分布,无明显聚集成点现象;在加入EGF激活ERK激酶后,原本在细胞质内均匀分布的GFP绿色荧光聚集成高亮度的绿色液珠.成功获得了可诱导表达检测ERK激酶活性的SPARK荧光探针的稳定细胞株,解决了瞬时表达ERK-SPARK探针效率不稳定影响实验结果准确性的问题,为后续建立基于SPARK技术的高通量蛋白激酶抑制剂的筛选平台奠定了前期研究基础.

人工核酸内切酶(engineered endonuclease,EEN) 系统介导的基因组编辑技术是进行基因组功能研究与生物遗传改良操作的重要工具.家蚕Bombyx mori 是最早实现人工驯化和饲养的经济昆虫,同时也是后基因组时代用作功能基因分析的重要鳞翅目模式昆虫.近年来随着锌指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN) 、类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN) 以及CRISPR/Cas9 系统介导的新型基因组靶向编辑技术的快速发展,家蚕基因组靶向编辑技术的研究和应用也取得了重要进展.本文概述了目前最为常用的3 种EEN 介导的基因组靶向编辑系统的组成和作用原理,全面系统地介绍了家蚕基因组靶向编辑技术的建立过程以及该技术介导实现家蚕内源或外源基因定点突变、基因组结构变异和外源基因在家蚕基因组定点整合操作的应用研究进展,探讨了家蚕基因组靶向编辑技术存在的内源靶基因定点敲除与外源基因定点整合效率较低、外源基因整合的"脱靶效应"等主要问题及相应解决策略,并对利用该技术实现家蚕多基因同时修饰的潜力和多种基因组靶向编辑系统的联合应用与多元化开发的发展趋势进行了展望,以期为推动基因组靶向编辑技术在昆虫基因功能分析、突变模型建立等研究领域的发展提供借鉴与参考.

近年来,基因工程技术发展迅速,许多重组蛋白得以表达.其中利用植物生物反应器表达特异药物蛋白为人类一些重要疾病的预防和治疗提供了新途径.植物叶绿体遗传转化和表达系统成为目前植物生物反应器的研究热点.因结构和遗传上的特殊性,高等植物叶绿体在重组蛋白表达方面具有独特优势,外源基因表达量高、定点整合,而且叶绿体母系遗传特性保证了生物安全性.很多重要药用蛋白质在植物叶绿体中表达成功.烟草作为高等植物叶绿体转化模式植物,在疫苗抗原、抗体等药物蛋白和其他重要重组蛋白表达方面取得显著进展.高等植物叶绿体遗传转化也为叶绿体基因的表达和调控机制的研究提供新的技术和方法.文中从叶绿体遗传转化原理、载体构建、重组蛋白和重要药物蛋白在叶绿体中的表达以及重组蛋白表达对植物代谢和性状影响等多个角度,对高等植物叶绿体遗传转化体系研究的新进展进行了综述,以期为叶绿体表达平台的开发和重要药用蛋白质的表达提供新思路.

宫颈癌是自身和环境共同作用下的复杂疾病.在宿主遗传易感性的基础上,高危型人乳头瘤病毒(HPV)持续感染并整合入宿主、宿主基因组的甲基化及体细胞突变等基因组及表观基因组特征变化在宫颈癌的发生和发展中具备分子分型、早期预警及指示预后的关键作用.因此,基于第二代测序技术的HPV等分子检测及动态机器学习模型将更精准地预测真正可能致癌的患者,减轻反复筛查负担;与此同时,基因编辑技术的靶向定点切割将使HPV感染相关宫颈病变的治疗成为可能.本文回顾了HPV相关宫颈癌分子生物学研究进展,提出未来我国宫颈癌精准防治的方向.