目的 探讨藏药经典方肺热普清散对小鼠肝炎病毒A59(MHV-A59)感染小鼠模型的影响及其对炎症因子的作用.方法 以雄性昆明种小鼠为实验对象,利用MHV-A59滴鼻操作建立小鼠冠状病毒感染模型,设置对照组、模型组、阳性(利巴韦林)组和肺热普清散低、中、高剂量(25、50、100mg·kg-1)3组,每天ig给药1次,连续给药10d,考察记录造模期内小鼠体质量变化,处死后称体质量并计算小鼠肺脏指数和肝脏指数;使用Elisa试剂盒测定小鼠血清中炎症因子白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-18(IL-18)含量;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测小鼠肝脏中IL-1β、IL-18的mRNA表达水平和血清中MHV-A59病毒载量;通过苏木素-伊红(HE)染色,检测肺热普清散对肝脏和肺脏细胞坏死及炎症细胞浸润的影响.结果 与对照组比较,模型组的体质量增长缓慢(P＜0.01);肺热普清散3个剂量组的体质量每日递增,中、高剂量组在第5～8天均与模型组有显著差异(P＜0.01);各组小鼠肺脏指数组间无显著性差异,肺热普清散中剂量组肝脏指数与模型组有显著性差异(P＜0.05);模型组病毒感染后血清中炎症因子IL-1β和IL-18显著性升高(P＜0.001),与模型组比较,肺热普清散3个剂量组均可降低血清中IL-18水平(P＜0.001、0.01);模型组肝脏组织中IL-1β和IL-18的mRNA表达水平均显著升高(P＜0.001);与模型组比较,肺热普清散高剂量组肝脏中IL-1β转录水平显著降低(P＜0.01);与模型组比较,肺热普清散3组实验动物肝脏组织中IL-18水平未出现显著性变化;MHV载量测定结果显示,与模型组比较,利巴韦林组和肺热普清散高剂量组血清中MHV载量显著性降低(P＜0.01);病理切片结果显示,模型组肝脏细胞出现广泛坏死和变性,并出现炎症细胞浸润,气球样变等现象,肺热普清散高剂量和利巴韦林组出现点状病灶、炎症细胞浸润等明显减少现象;模型组肺组织肺泡明显间隔增厚,间质水肿,肺泡被压缩,有炎症细胞浸润,毛细血管扩张充血等现象,而肺热普清散中、高剂量组和阳性组肺组织肺泡间隔较窄,肺泡舒展,局部有炎性浸润和出血,肺泡腔内的分泌物明显减少.结论 肺热普清散对MHV-A59感染小鼠模型具有保护作用,其作用机制与抑制病毒复制和抑制感染后炎症因子有关.

目的 建立小鼠肝炎病毒(Mouse Hepatitis Virus,MHV)血清抗体ELISA检测方法,用于本地区MHV的日常监测,以便对SPF小鼠感染状况及时作出判断.方法 选取3种MHV毒株MHV1、MHV-JHM和MHV-A59,通过L929细胞扩增培养获得纯化浓缩抗原并筛选适合包被抗原类型;免疫BALB/C小鼠,获得高效价免疫阳性血清;优化ELISA反应体系建立规范化的ELISA试剂盒并用于临床小鼠血清样品的检测.结果 筛选出适合本地区的MHV包被抗原类型为MHV1,建立了病毒扩增及浓缩纯化方法,制备的MHV抗血清达到同批次大量高滴度的水平,可作为标准化质控血清.包被抗原、待检血清和酶结合物最佳工作浓度分别为4.0 μg/mL(10-7.73/0.1 mL TCID50)、1∶40和1∶4 000稀释;批次内和批次间平均变异系数分别为5.13％和5.57％;检测灵敏度为1∶4 000稀释;与小鼠仙台病毒(SV)、小鼠肺炎病毒(PVM)、呼肠孤病毒Ⅲ型(Re03)、小鼠细小病毒(MVM)和鼠痘病毒(Ect)阳性血清均无交叉反应.稳定性试验相对偏差小于10％.对165份血清样品进行检测,阳性血清相符率97.37％ (37/38),阴性血清相符率92.19％ (118/127).结论 本研究建立的ELISA方法检测小鼠血清MHV抗体具有较高的特异性、敏感性和结果可重复性,可以用于本地区MHV日常病原学监测,以便对小鼠感染状况作出准确判断.

目的 研究独立通风笼具换笼标准操作程序与实验动物负压屏障设施内使用IVC(individual ventilated cage,IVC)设备饲养小鼠的病毒感染风险.方法 选择小鼠易感的小鼠肝炎病毒(MHV)A59株感染6周龄BALB/c雄性小鼠,按照IVC换笼标准操作程序进行换笼操作;使用IFA和ELISA血清学方法以及针对MHV的核酸检测方法测定同一笼架具相邻笼盒、同一IVC系统不同笼架具的不同位置、以及IVC系统外负压屏障设施内哨兵动物的MHV感染情况.结果 接种病毒小鼠在感染6 d后出现临床症状,粪便中可检出MHV病原;动物感染3周后可检出MHV抗体阳性;其他监测组在5周实验终点均无MHV阳性检出.结论 IVC换笼标准操作程序可指导IVC换笼操作,用以控制病毒类病原对小鼠的感染风险.

为了探究补体系统与戊型肝炎病毒复制的相关性,分别在HEV感染的A549细胞和BALB/c小鼠中检测C3aR、CD55和CD59蛋白的表达.利用RT-qPCR定量检测细胞和组织中补体的表达,采用免疫组化法检测HEV感染BALB/c小鼠中补体CD59及C5b-9的表达,ELISA检测补体相关炎症因子的变化.HEV感染可以激活补体蛋白C3aR、C5b-9、CD55和CD59的表达,引起补体蛋白相关炎症因子IL-10表达水平下降,IL-12和TNF-α的表达水平的上升,从而导致机体的炎症反应,加剧组织损伤.HEV感染激活补体系统并参与早期的抗病毒反应,HEV感染对补体的持续激活导致炎症因子过度表达,加重机体损伤.

作者用5株小鼠肝炎病毒(MHV-1、MHV-3、-JHM、-A59和-沪79)研制了以多价抗原检测MHV抗体的ELISA试剂盒.该试剂盒与MHV-3抗体试剂盒对222份淘汰 小鼠血清的MHV抗体检出率分别为60.81％(135/222)与49.55％(110/222),对44份普遍鼠群血清样本的检出率也表明该试剂盒较单价抗原敏感;试剂盒与Ect、LCM、EHF、Sendai和Reo-3病毒的抗体无交叉反应,阻断试验结果也表明其特异性好;试剂盒在-20℃至少可保存4个月.在室温或2～8℃至少可保存5周;其重复性好,操作简便.

目的 原核表达甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)衣壳蛋白VP1和VP3,并评价其免疫原性.方法 PCR法扩增VP1和VP3基因片段,克隆至载体pET-G28a中,构建重组表达质粒pET-G28a-VP1和pET-G28a-VP3,转化至感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,12％SDS-PAGE分析表达产物.目的蛋白经离子交换层析纯化,复性后与多种佐剂配伍,免疫雄性 BALB/c 小鼠,随机分为 VP1-MF59、VP1-AH、VP1-AP、VP1-AP-10CpG、VP1-AP-50CpG、VP3-AP、VP3-VP1-AP及PBS对照组,每组5只.ELISA法检测各组小鼠血清中IgG抗体效价,快速荧光灶免疫抑制试验测定VP1-AP、VP3-VP1-AP及PBS对照组小鼠血清中和抗体效价.结果 菌落PCR及测序结果证明,重组表达质粒pET-G28a-VP1及pET-G28a-VP3构建正确.重组蛋白VP1和VP3相对分子质量分别约为37 000和26 000,主要以包涵体形式存在,表达量分别为18.6％和32.4％,纯度分别为86.3％和84.7％,且分别可与兔抗HAV抗血清及鼠抗HAV-VP3抗血清发生特异性结合.VP1-AP-50CpG组小鼠血清的IgG抗体效价显著高于VP1-AP组(q=22.05,P＜0.01),VP3-VP1-AP组小鼠血清的IgG抗体效价显著高于VP1-AP及VP3-AP组(q分别为22.05和22.49,P均＜0.01).与PBS对照组比较,VP1-AP及VP3-VP1-AP组小鼠血清的中和抗体效价显著升高(q分别为7.79和25.11,P＜0.01).结论 原核表达的HAV衣壳蛋白VP1和VP3纯度较高,且具有良好的免疫原性,制剂中添加CpG有利于增强抗原的免疫原性.本研究为HAV重组亚单位疫苗的研发奠定了基础.