尘螨是主要的过敏原之一，广泛分布于全球各地，尤其是在家庭环境中，屋尘螨、粉尘螨和热带无爪螨是最常见的种类。已知的尘螨致敏组分超过35种，其中Der p 1、Der p 2和Der p 23是主要组分。目前，临床主要采用粗提物进行皮肤点刺试验和血清特异性免疫球蛋白E（specific immunoglobulin E，sIgE）检测进行尘螨过敏的初步诊断，不能精确识别具体的致敏组分。考虑到不同地区和人群对尘螨的致敏蛋白存在显著差异，尘螨过敏原组分诊断在精确确定致敏组分方面显得尤为重要。这不仅对于过敏原的回避有指导意义，也对确定尘螨免疫治疗方案至关重要。为加强对尘螨分子诊断的认识并促进我国变态反应学科与国际接轨，本文对近期欧洲过敏与临床免疫学会发布的《过敏原组分诊断指导建议2.0》进行内容解读与阐释。

目的:采用纳米磁微粒化学发光免疫技术建立尘螨过敏原第1、2组分(Der p 1、Der p 2)特异性免疫球蛋白E(sIgE)的定量检测方法。方法:通过优化试剂组份和反应模式，评估纳米磁微粒化学发光免疫技术检测Der p 1、Der p 2 sIgE的各项性能指标。同时检测50例疑似尘螨过敏患者血清Der p 1、Der p 2 sIgE水平，与Phadia系统测定结果为标准进行比较，其一致性的比较采用 Kappa检验。 结果:最佳实验体系为：磁微粒用量25 μg，反应缓冲液(pH值7.4)含0.1 mol/L Tris-HCl、质量分数0.25%酪蛋白，包被液含20 mmol/L磷酸缓冲液(PB)、质量分数1%牛血清白蛋白(BSA)，发光增强液含体积分数0.05% Triton X-100，采用两步法免疫反应，样本量为20 μl，反应温度为37 ℃。检测体系最低检出限小于0.01 kU/L，线性范围0.2~100.0 kU/L，批内、批间精密度分别小于5%、7%，Der p 1和Der p 2交叉污染率分别为0.19%、0.21%。与Phadia系统测定结果比较，Der p 1阳性、阴性符合率分别为78.0%(32/41)、9/9，一致性较好( Kappa＝0.65， P＝0.008)；Der p 2阳性、阴性符合率分别为93.3%(28/30)、85.0%(17/20)，一致性也较好( Kappa＝0.79， P＝0.003)。 结论:成功建立了尘螨过敏原Der p 1、Der p 2 sIgE纳米磁微粒化学发光免疫检测方法，其各项性能指标良好，与Phadia系统有较好的一致性。

支气管哮喘是一种异质性疾病，尘螨是引起I型过敏反应的主要过敏原，尘螨致敏蛋白和致敏组分引起的过敏反应及炎症反应在哮喘的发生和发展中起至关重要的作用。进而，在气道上皮的炎症细胞因子作用下产生的一氧化氮及其衍生物在诱导哮喘中发挥重要作用。该文综述近年来尘螨自身致敏蛋白及其致敏相关成分和呼出气一氧化氮在哮喘发病中的作用。

目的:探讨过敏原皮下特异性免疫治疗（subcutaneous immunotherapy，SCIT）在治疗早期对患者免疫指标和代谢水平的影响，深入了解SCIT治疗在调节免疫反应和代谢水平方面的作用，为进一步发现潜在生物标志物提供参考数据。方法:采用纵向研究方法，纳入2017年11月至2022年2月期间于广州医科大学附属第一医院儿科接受尘螨过敏原SCIT的受试者40例，其中单螨制剂治疗（single mite subcutaneous immunotherapy，SM-SCIT）和双螨制剂（double mite subcutaneous immunotherapy，DM-SCIT）治疗受试者各20例。本研究检测了受试者治疗前和治疗12个月后的尘螨过敏原特异性抗体和多元不饱和脂肪酸代谢水平，同时进行了肺功能检查，并通过症状视觉模拟量表（visual analogue scale，VAS）、哮喘控制测试问卷（asthma control test，ACT）和用药总评分（total medication scores，TMS）对患者的疗效进行随访，采用 t检验、Mann-Whitney U检验等方法进行结果统计分析。 结果:经SCIT治疗12个月后，两组的VAS总分（SM-SCIT： Z=-2.298， P<0.05；DM-SCIT： Z=-3.411， P<0.001）显著下降；ACT总分（SM-SCIT： Z=-2.054， P<0.05；DM-SCIT： Z=-2.014， P<0.05）和总用药评分（SM-SCIT： Z=-3.799， P<0.000 1；DM-SCIT： Z=-3.474， P<0.001）显著升高，此外，双螨治疗组MMEF75/25值显著升高（ t=-2.253， P<0.05）。单螨治疗组的sIgE无明显变化（ P>0.05），Der p、Der f、p 1、p 2、f 2和p 21组分sIgG 4水平均显著升高（ Z分别为-2.651、-3.771、-2.949、-2.912、-2.725、-2.128、-3.285， P均<0.05）；双螨治疗组的 Der p 2、f 2、p 7和p 23 组分sIgE（ Z分别为-1.965、-2.028、-2.406、-2.134， P均<0.05）和Der p、Der f、p 1、p 2、f 1、f 2、p 10、p 21和p 23组分sIgG 4水平均显著升高（ Z分别为-3.808、-3.845、-3.061、-2.688、-2.464、-3.211、-2.371、-2.091、-2.427， P均<0.05）。代谢组学分析显示，在治疗初期，SM-SCIT治疗后花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳五烯酸、5，9，12-十八碳三烯酸、5（S）-羟化二十烷四烯酸、二高-γ-亚麻酸显著升高（ Z分别为-2.191、-2.497、-1.988、-2.090、-2.19、-2.803、-2.073， P均<0.05）；DM-SCIT组治疗后5（S）-羟化二十烷四烯酸显示升高，α-亚麻酸、二十碳二烯酸、二十碳一烯酸显著下降（ Z分别-1.988、-2.090、-2.497、-1.988， P均<0.05）。相关性分析表明，花生四烯酸与尘螨特异性IgG 4的变化呈显著负相关（ r=-0.499， P<0.05），α-亚麻酸、5，9，12-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸与尘螨der p 2的ΔsIgG 4（ r分别为0.451、0.420、0.474， P均<0.05）呈正相关。 结论:SCIT期间过敏原特异性抗体水平和多不饱和脂肪酸代谢水平发生显著变化，并且两者之间可能相互影响、相互作用。

尘螨是引起过敏性呼吸疾病的最常见过敏原之一.热带无爪螨是热带和亚热带地区的优势螨种,随着全球气候变暖,其在温带地区分布增加,致敏率持续升高,成为继屋尘螨、粉尘螨之后又一重要致敏螨种.本文就热带无爪螨在全球各地的分布、致敏率、过敏原组分免疫生物学特征及交叉反应等予以综述,期望临床医生重视该螨种的致敏性,并对该螨种的基础研究方向进行展望,进而为特异性诊断和免疫治疗策略的开发提供帮助.

本研究制备并鉴定了鼠抗粉尘螨变应原Der f 5的单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb).将质粒pET28a(+)Der f 5转化ArcticExpress (DE3)感受态细胞,取单个菌落接种培养,加入IPTG诱导表达,经纯化获得Der f 5重组蛋白.利用Der f 5重组蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾脏细胞与其骨髓瘤细胞融合.通过间接ELISA法筛选特异性分泌抗体的杂交瘤细胞.用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用蛋白A亲和层析法进行抗体纯化.通过间接ELISA、Western blotting鉴定该单克隆抗体的特性和交叉性.最终获得3株稳定分泌鼠抗粉尘螨变应原Der f 5的高效价单克隆抗体.研究分析表明该3株单抗均能识别重组Der f 5蛋白和天然的粉尘螨提取物.本实验成功制备了3株鼠抗粉尘螨变应原Der f 5的单克隆抗体,为建立粉尘螨主要变应原Der f 5检测及纯化方法奠定了基础.

目的 获得粉尘螨变应原第6组分(Der f6)的编码基因并了解其序列多态性. 方法 根据GenBank(AF125187)公布的Der f6的CDS区序列设计引物,使用PrimeSTAR? HS DNA进行PCR扩增,将目的基因片段与pMD19-T simple连接,进行序列测定和多态性分析. 结果 获得粉尘螨Der f 6编码基因,大小为839 bp.对5个Der f6克隆质粒测序并与参考序列GenBank No.AF 125187和GenBank No.EU085359比对,出现突变的cDNA序列合计36处,cDNA克隆中序列存在27处突变至少达到3个;推导的氨基酸序列有15处与上述27个位点一致.结论 获得粉尘螨Der f6编码基因并证明其序列具有多态性,为相关研究奠定了基础.

目的 建立粉尘螨变应原第2组分(Der f2)血清特异性IgE的酶联免疫吸附测定(ELISA)法,并评价其检测效能.方法 利用重组表达的Der f2作为包被抗原,分别建立检测Der f2血清特异性IgE的间接ELISA法和亲和素-生物素复合(ABC)-ELISA法,采用正交试验筛选两种方法的最优检测条件.分别采用上述两种ELISA法检测Der f2特异性IgE阳性标准血清,绘制两种ELISA法检测Der f2特异性IgE的标准曲线;同时以Pharmacia UniCap系统检测结果为金标准,计算两种ELISA法检测46例哮喘患者血清Derf2特异性IgE的结果符合率.结果 间接ELISA法检测Derf2特异性IgE的最佳条件为:包被液浓度为10 μg/ml,血清稀释倍数为1∶5,辣根过氧化物酶(HRP)标记抗人lgE抗体稀释倍数为1∶1 000.ABC-ELISA法检测Der f2特异性IgE的最佳条件为:包被液浓度为15 μg/ml,血清稀释倍数为1∶5,生物素标记抗人lgE抗体稀释倍数为1∶1000,HRP标记的链霉和素稀释倍数为1∶2000.间接ELISA和ABC-ELISA法的灵敏度值分别为0.72 U/ml和0.69 U/ml.间接ELISA和ABC-ELISA检测哮喘患者的符合率分别为93.5％和95.7％.结论 成功建立基于重组表达Der f2的ELISA法,其对Der f2特异性IgE具有较好的检测效能.

目的 分析屋尘螨变应原制剂外观异常对其质量的影响.方法 依据进口药品注册标准(JS20130104)对1批(T6469)屋尘螨变应原制剂进行全面质量检定,同时与检定合格样品(A3016、A3064及A3110批)进行相应比对,Western blot鉴定主要变应原组分,纳米粒径颗粒分析仪检测制剂中铝佐剂-蛋白吸附物的中值粒径(D50).选取检定合格样品进行冷冻模拟验证,观察低温冷冻对制剂外观性状的影响.结果 T6469批制剂外观不均一(外观性状异常与正常样品),混悬液浊度有差异,部分样品出现摇不散的贴壁颗粒,外观性状异常样品与正常样品比较,浑浊度降低,沉降速度增快,铝佐剂吸附物液面高度明显低于外观正常样品.经检定,T6469、A3016、A3064及A3110批制剂pH、铝含量、苯酚含量及游离上清活性均在质量标准范围内,在相对分子质量25 000及14 000处均出现特异性条带,但T6469批外观性状异常样品条带变弱.T6469外观性状异常与正常样品之间D50差异有统计学意义(P＜0.05);检定合格样品冻存前后D50差异有统计学意义(P＜0.05).T6469批外观性状异常样品与正常样品和检定合格样品比较,总生物学活性明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05).检定合格样品放置低温环境至冻结后重现了上述外观异常性状,生物活性与未处理样品相比显著降低(P＜0.05).结论 该批屋尘螨变应原制剂的外观异常可能是由于样品贮存及运输中出现低温冻结,引起铝佐剂-蛋白凝胶颗粒出现聚集,形成较大颗粒,最终导致其生物活性显著降低.

目的:制备过敏原Der p 23重组蛋白并建立其特异性IgE化学发光免疫检测方法.方法:以屋尘螨Total RNA为模板,依据GenBank公布的序列(No.EU414751)设计并合成引物,RT-PCR扩增Der p 23编码基因,构建原核表达质粒pET28a(+)-Der p 23,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,柱层析纯化收集目的蛋白并采用SDS-PAGE、Western blot鉴定.以此重组蛋白包被化学发光板,建立化学发光免疫分析法检测经ImmunoCAP检测的过敏性鼻炎或/和过敏性哮喘患者血清.结果:纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定可见单一条带,定量分析呈现0.5ml、0.25 mg/ml、纯度＞95％的重组蛋白纯化成功.以该重组蛋白建立化学发光方法检测屋尘螨过敏性哮喘或/和过敏性鼻炎患者血清,阳性率为89.8％,以国际金标准ImmunoCAP方法同步检测Der p 23单组分特异IgE阳性率为95.92％,两种方法检测结果差异无统计学意义(x2=0.237,P=0.626).结论:获得了屋尘螨过敏原重组蛋白Der p 23,成功建立了其化学发光免疫检测方法,为过敏原单组分分辨诊断方法建立提供了技术平台.