目的 制备川西獐牙菜的抑菌活性部位并建立其HPLC谱效关系指纹图谱.方法 采用三相萃取法制备川西獐牙菜的活性部位,体系1用乙腈-二氯甲烷-石油醚-水(5∶1∶5∶5)、体系2用乙腈-乙酸乙酯-石油醚-水(1∶1∶2∶1)萃取;通过牛津杯法测定各部位的抑菌活性,采用Pearson相关性分析与正交偏最小二乘判别分析研究HPLC指纹图谱的谱效关系.结果 川西獐牙菜抑菌活性成分主要富集于体系1、2的中相,6个不同部位共有峰20个,其中,7、12、15、16、19、20号峰与抑菌活性呈显著正相关.结论 所用方法可有效富集川西獐牙菜的活性成分,可为川西獐牙菜抑菌活性成分的制备及质量控制与评价提供参考.

目的 建立"蒂达"类藏药川西獐牙菜的HPLC指纹图谱,并结合化学计量学分析进行常用"蒂达"类藏药川西獐牙菜药材的质量分析.方法 采用Waters SunFireC18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以甲醇-水(含0.05％磷酸)为流动相,进行梯度洗脱,流速1.0 mL·min-1,检测波长254 nm,柱温30℃.对不同来源和不同批次的川西獐牙菜进行指纹图谱测定,并通过化学计量学系统解决方案软件(ChemPattern2017版)对结果进行处理分析.结果 14批次川西獐牙菜药材与生成对照指纹图谱的相似度在0.923～1.000,具有较好的一致性.标定了 22个共有峰,并对其中9个峰进行了指认,分别为马钱苷酸、獐芽菜苦苷、龙胆苦苷、当药苷、芒果苷、异荭草素、当药醇苷、1,8-二羟基-3,7-二甲氧基(岫)酮、8-O-β-D-吡喃葡萄糖-1,3,5-三羟基(血)酮.主成分分析提取出3个主成分进行综合评价,可以反映样品数据中的绝大部分信息.聚类分析将样品分为2类,采集于青海地区的样品S01、S02、S04～S13聚为一组,采集于四川、西藏地区的样品S03、S14聚为一组.结论 该方法科学、准确且简便易行,方法精密度、稳定性和重复性良好,专属性强,可以作为常用"蒂达"类藏药川西獐牙菜的质量控制方法.

川西獐牙菜是一种珍稀的中藏药材,目前对于川西獐牙菜的研究主要集中在药用疗效和药用价值方面,而基于遥感与GIS适宜性分布研究较少.运用遥感和GIS技术来研究分析四川省川西獐牙菜适宜性分布区域,为野生资源保护开发、人工引种栽培以及调整四川省中药产业布局提供了科学依据.该研究在文献查阅和分析川西獐牙菜分布适宜性的海拔、年降水、年均温等生态因子基础上,基于遥感与GIS技术,获取生态因子、叠加分析、结合GPS野外验证数据,对四川省川西獐牙菜的适宜性分布区域进行了研究.①川西獐牙菜在四川省适宜分布面积为1 543.749 km2,主要分布在德格县、甘孜县、道孚县、康定县、马尔康市、金川县、小金县、丹巴县、稻城县、乡城县、新龙县、阿坝县、木里县等县市,占该区县市总面积的7.25％;②相关资料以及野外实地验证调查发现,通过GIS得到的川西獐牙菜适宜分布区域与实际分布情况基本吻合.研究表明基于遥感与GIS技术提取川西獐牙菜适宜分布区是可行的,可以应用到其他道地珍稀中药材的适宜性分布区域研究.

该研究根据川西獐牙菜转录组信息获得7-脱氧马钱子酸羟化酶(SmDL7H)基因的全长cDNA序列,对该基因进行同源克隆、生物信息学分析,并构建原核表达载体、转化大肠杆菌、进行原核表达和组织特异性表达分析,以探讨川西獐牙菜裂环烯醚萜合成途径中关键酶7-脱氧马钱子酸羟化酶(SmDL7H)基因的功能,为研究裂环烯醚萜类化合物合成途径奠定基础.结果表明:(1)成功克隆了川西獐牙菜SmDL7 H基因(GenBank登录号为MH243070);SmDL7H基因开放阅读框为1554 bp,编码517个氨基酸,相对分子质量为59.5 kD,等电点9.02;生物信息学预测SmDL7 H基因编码蛋白无信号肽.(2)多序列比对及进化树分析显示,SmDL7 H编码的蛋白与滇龙胆、长春花、金银花等植物的DL7 H基因编码的蛋白具有较高相似性.(3)将SmDL7 H基因连接到pET-28a原核表达载体,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),用0.1 mol/L IPTG于25℃诱导12 h,原核表达分析发现在59.5 kD处有目的蛋白出现,表明与之前预测的蛋白大小一致.(4)荧光定量PCR分析显示,SmDL7 H基因在川西獐牙菜叶、茎、花、根、愈伤组织中均有表达,其中在叶片中表达量最高,在根中表达量最低.

本文对川西獐牙菜Swertia mussotii Franch的化学成分及抗肿瘤活性进行研究.通过采用多种柱层析及半制备等方法对川西獐牙菜乙酸乙酯部位进行分离纯化得到10个化合物;利用其理化性质并结合现代波谱分析方法鉴定化合物的结构;分别为1,5,8-trihydroxy-3-methoxyxanthone(1)、1,7-dihydroxy-3,8-dimethoxyxanthone (2)、1-hydroxy-3,5,8-trimethoxyxanthone(3)、1-hydroxy-3,7,8-trimethoxyxanthone(4)、4,6,8-trihydroxy-1,2,3,5-tetramethoxyxanthone (5)、Luteolin(6)、Isoorientin(7)、Isovitexin(8)、Swertiamarin(9)、Gentiopicroside(10),其中化合物5为首次从龙胆科植物中分离得到,化合物6、8为首次从川西獐牙菜中分离得到.选用黑色素瘤B16细胞模型、神经胶质瘤C6细胞模型和肝癌HepG2细胞模型进行细胞毒性实验,结果表明,化合物5对神经胶质瘤C6细胞表现出相对明显的抑制活性,其IC50值达8.9 μM.

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶 (1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase, DXS) 是2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸 (MEP) 途径的第一个关键酶.该研究根据川西獐牙菜Swertia mussotii转录组数据, 克隆获得其DXS2基因 (Gen Bank注册号MH535905) , 命名为Sm DXS2.生物信息学分析表明Sm DXS2基因无内含子, 其开放阅读框全长2 145 bp, 编码714个氨基酸, 分别属于20种氨基酸, 其中丙氨酸、甘氨酸和色氨酸含量最高;相对分子质量为76. 91 k Da, 理论等电点为6. 50, 属亲水性蛋白;二级结构中α-螺旋占36. 83％, 延伸链占9. 38％, loop占53. 78％;序列内部无信号肽, 没有跨膜区, 为非分泌型蛋白;序列中含有TPP结合位点、嘧啶结合结构域和C端的转酮酶结构域;系统发育分析结果显示Sm DXS2与滇龙胆DXS2共聚于一个分支.Sm DXS2基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为94 k Da, 与预测蛋白大小一致.该研究为进一步探讨该基因的功能和利用基因工程手段提高川西獐牙菜中环烯醚萜类化合物产量提供了理论依据.

裂环马钱子苷合成酶(SLS)是环烯醚萜类化合物合成途径的限速酶.该研究根据川西獐牙菜转录组信息获得SmSLS2基因序列,对该基因进行克隆、生物信息分析、原核表达载体构建及蛋白体外诱导.结果 表明SmSLS2cDNA全长1 566 bp(GenBank编号MH535904),编码521个氨基酸,推测其蛋白相对分子质量为59.79kDa,等电点为8.92.结构域分析表明SmSLS2含一个跨膜结构域,SmSLS2的gDNA全长为2 576 bp,含5个外显子和4个内含子.SmSLS2蛋白与其他植物中SLS蛋白具有高度的相似性.进一步将SmSLS2构建到原核表达载体pET-28a-sumo上,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,在37cC、0.5 mmol·L-1 IPTG条件下进行原核表达,诱导出与预测蛋白大小一致的目的蛋白.该研究成功从川西獐牙菜中克隆了SmSLS2,为进一步阐明该基因在环烯醚萜合成途径中的作用和通过基因工程手段改良环烯醚萜类化合物产量提供了理论基础.

目的:建立川西獐牙菜的HPLC指纹图谱,研究不同产地样品化学成分与生态因子的相关性.方法:采用高效液相色谱法(HPLC),采用Wondasil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相甲醇-0.2％磷酸溶液,梯度洗脱,柱温30℃,流速1.0 mL· min-,检测波长254 nm,建立川西獐牙菜的指纹图谱,结合国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”进行评价分析;并收集各产地样品的气候、土壤等生态因子数据,利用DPS数据处理系统,SPSS 21.0统计软件对不同产地药材的化学成分与生态因子进行灰色关联度和双变量分析.结果:建立了川西獐牙菜药材的HPLC指纹图谱,共标定12个共有特征指纹峰,确定了7个峰的化学成分;川西獐牙菜中的獐牙菜苦苷、芒果苷等化学成分与生态因子具有显著的相关性,对化学成分影响较大的为气候因子中的月均温范围、年降水量和降水季节性,以及土壤因子中的土壤中有机碳比例和土壤酸碱度.结论:川西獐牙菜药材的化学成分与外部生态因子有一定的相关性,研究结果为该药材的人工种植及藏族药“生地性”理论诠释提供了参考依据.

目的 了解川西獐牙菜Swertia mussotii Franch甲羟戊酸途径中的关键酶甲羟戊酸激酶基因(MK)的功能,并进一步推进川西獐牙菜中的甲羟戊酸途径的研究.方法 根据川西獐牙菜的转录组信息,获得了川西獐牙菜MK (SmMK)基因的全长cDNA序列,并且设计了特异性引物,利用RT-PCR对该基因进行了克隆;利用生物信息学方法,对SmMK基因的序列进行分析;构建原核表达载体MBP-SmMK,转入大肠杆菌Rosetta (DE3)中,然后对SmMK基因进行了原核表达,并对其进行了纯化.结果 SmMK基因cDNA全长为1 164bp,共编码387个氨基酸.SmMK与其他植物中的MK具有较高相似性.对其信号肽、跨膜区域、蛋白定位及二级结构和三维构象进行了预测分析.SDS-PAGE检测表明所纯化蛋白与预期蛋白的大小相一致,为40 970.结论 为进一步研究川西獐牙菜中MK的功能奠定了基础,并为进一步研究川西獐牙菜中的甲羟戊酸途径,提高川西獐牙菜中类异戊二烯化合物的产量提供了依据.

目的 测定青海不同的獐牙菜植株及其种子的微量元素含量,分析其主要微量元素特征和抑癌主要品种,为保护野生獐牙菜资源和大规模培育具有纯正药性的獐牙菜提供理论依据.方法 采用原子吸收法测定青海省称多县及祁连地区野生獐牙菜中铜、锌、铁、锰、铬、铅、镉、硒的含量,用HPLC-ICP-MS法测定样品中汞的含量,用原子荧光法分析测定样品中砷的含量,用SPSS软件分析进行相关性分析、主成分分析和聚类分析.结果 Cr与Fe、Zn与Cu、Hg与As、Cd与Pb呈极显著正相关关系;Se与Fe、Mn、Cr呈极显著正相关关系,与Cu、Zn、Cd、Hg呈极显著负相关关系;Hg与Zn呈显著正相关关系.Fe、Cu、Zn、Mn 4种成分的方差累积贡献率达到97.458％,可以用来表征各种獐牙菜样品中所含微量元素的整体情况,4种獐牙菜全草和4种种子可分为3类,紫花川西獐牙菜全草单独聚为一类.结论 獐牙菜微量元素含量具有明显的种群特征和地域特征,富硒紫花獐牙菜在中药抑癌应用上具有更好的前景.