以黄独微型块茎为材料,进行了4℃低温离体保存,并对其进行了转录组分析.结果表明:原始数据进行质量预处理后,对照组(Con25)和处理组(Con4)的reads有效比分别为98.67％和98.69％;对拼接序列去重复后最终得到了219 792个长度大于200bp的transcripts(177 Mb)和161066个Unigenes (99 Mb);Unigenes的NR注释数目最多的10个物种分别为出芽短梗霉EXF-150、葡萄、可可、水稻粳稻组、无油樟、谷子、出芽短梗霉变种nami-biae CBS 147.97、麻疯树、短至生黑醋杆菌CBS 110374和无花果拟盘多毛孢w106-1;样本注释基因最多的5个KOG是一般的功能预测、信号转导机制、翻译后修饰和蛋白质周转以及伴侣、翻译和核糖体结构和生物合成、能源生产和转换;样本KEGG注释Unigenes最多的5个pathway分别为碳代谢、氨基酸生物合成、糖酵解途径、淀粉蔗糖代谢和丙酮酸代谢.注释到的Unigenes个数为26006,注释到的不同酶数为1 177,映射到的不同pathway数为327;样本基因的功能在Biological Process分类中主要聚集于cellular process和metabiolic process,在Cellular Component分类中主要聚集于cell和cell part,在Molecular Function分类中主要聚集于binding和catalytic activity;在黄独微型块茎低温离体保存中,共获得164 145个差异表达基因,其中有63 305个基因表达上调,有100 840个基因表达下调;差异表达基因部分极其显著的GO term有液泡继承、单链断裂修复、纺锤体伸长、麦芽糖分解代谢过程、甘露糖基转移酶的活性、甘露糖磷酸转移酶活性、细胞壁甘露糖蛋白的生物合成过程、G1期细胞有丝分裂周期早期细胞芽和有丝分裂纺锤体定位的建立;差异表达基因部分极其显著的pathway有原发性胆汁酸的生物合成、类固醇激素的合成、氯代环己烷和氯苯降解、双酚A降解、氟苯甲酸降解、糖胺聚糖合成硫酸软骨素、糖胺聚糖合成硫酸乙酰肝素、甲苯降解、萘的降解和核黄素代谢.本实验结果可为黄独微型块茎的种质保存和后续萌发提供理论依据.

GC/MS检测方法采用初步探明黄独低温离体保存微型块茎的差异代谢物.与黄独微型块茎25℃离体保存相比较,黄独微型块茎4℃离体保存的差异性代谢物有丙氨酸(Alanine)、儿茶素(Catechin)、N,N-双(2-羟乙基)甲胺(N,N-Di-(2-Hydroxyethyl)-methanamine)、水杨酸(Salicylic acid)、柠檬酸(Citric acid)和山梨糖(Sorbose)等.在黄独微型块茎4℃离体保存中,丙氨酸(Alanine)参与氰基氨基酸代谢;儿茶素(Catechin)参与次生代谢产物生物合成、黄酮类化合物的生物合成和苯丙素的生物合成;水杨酸(Salicylic acid)参与多环芳烃降解、微生物在不同环境中的代谢、植物激素信号转导、次生代谢产物生物合成、二恶英降解、苯丙氨酸代谢、芳烃降解、植物激素生物合成、铁载体组非核糖体肽合成和苯丙素的生物合成等.柠檬酸(Citric acid)参与来自鸟氨酸、赖氨酸和烟酸的生物碱生物合成、组氨酸和嘌呤的生物碱生物合成、微生物在不同环境中的代谢、植物次生代谢产物的生物合成、2-氧代羧酸代谢、萜类和类固醇的生物合成、原核生物固碳途径、次生代谢产物生物合成、来自莽草酸途径的生物碱生物合成、来自萜类化合物和聚酮的生物碱生物合成、柠檬酸循环(TCA循环)、植物激素生物合成、乙醛酸和二羧酸代谢、双组分系统、苯丙素的生物合成以及来自鸟氨酸,赖氨酸和烟酸的生物碱生物合成等.黄独低温离体保存微型块茎差异代谢物的初步发现为进一步了解其低温离体保存的分子机制奠定了基础,也为低温离体保存黄独微型块茎的破除休眠以及其后续萌发提供了理论依据.

目的:探讨植物生长促进剂在半夏试管微型种茎形成中的作用,研究半夏块茎型人工种子生产技术.方法:以野生宽叶半夏的带芽块茎为外植体,优化植物生长促进剂的添加设计,筛选适宜的试管微型种茎诱导、增殖培养基及种茎萌发、成苗配套技术.结果:以MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA为试管微型种茎的最佳诱导培养基;以MS+ 1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA为最佳增殖培养基;种茎移栽中,10 mm以上种茎发芽率、发芽势、发芽指数最高,分别为95.7％、89.3％、87.1,且幼苗的成活率最高、株高最大、叶片数最多,分别为99.3％、11.8 cm、6.2片.结论:以6-BA与IBA优化配比,能显著提高半夏试管微型种茎的形成,建立了野生优质宽叶半夏高效试管微型种茎繁育技术体系.

本研究利用TMT标记+LC-MS/MS技术来探明黄独低温离体保存微型块茎的差异蛋白.研究表明,所有肽段的mass error进行统计,大多数mass error ＜0.02 Da,且其分布均在0附近,MS数据比较精确,符合检测要求.大多数肽段的长度分布在8～16之间,符合tryptic酶切肽段的理论值,表明样本的前处理也符合要求.差异蛋白为106个,其中上调差异蛋白61个,下调差异蛋白45个.排名前10位差异蛋白分别为伸长因子3、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、蔗糖合成酶、光系统Ⅱ的贮藏蛋白质、未知蛋白、分子伴侣DNAK、α-淀粉酶、S-腺苷甲硫氨酸合成酶和淀粉磷酸化酶,其中伸长因子3、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、蔗糖合成酶、分子伴侣DNAK和S-腺苷甲硫氨酸合成酶为在4℃低温离体保存中上调的蛋白,而未知蛋白、α-淀粉酶、淀粉磷酸化酶为在4℃低温离体保存中下调的蛋白.经过wego分析后,所有检测到的蛋白主要聚集于代谢过程、细胞过程细胞、绑定、催化等GO terms.通过富集,晚期内体膜、钙离子结合、谷胱甘肽转移酶活性、蛋白定位到液泡、高尔基液泡运输、液泡运输、氨基末端肽结合空泡分选和披网格蛋白小泡膜等GO term富集显著.富集的KEGG pathway主要有乙醛酸盐代谢、光合作用、甲烷代谢、碳水化合物的消化和吸收、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢和碳代谢.黄独低温离体保存微型块茎差异蛋白的初步发现为进一步了解其低温离体保存的分子机制奠定了基础,也为低温离体保存黄独微型块茎的破除休眠以及其后续萌发提供了理论依据.

怀山药(Dioscorea opposita)遗传转化是对其进行基因功能分析和遗传改良的基础,但目前国内外尚未见相关报道.以怀山药优良品种铁棍山药(D.opposita cv.‘Tiegun’)的微型块茎为受体材料,对影响遗传转化的因素进行优化,建立了由根癌农杆菌介导的山药遗传转化体系.过表达质粒载体pCAM BIA1301-DoSERK2含GUS标记基因和潮霉素(Hyg)抗性筛选基因,沉默质粒载体pART27-DoSERK2含卡那霉素(Kan)抗性筛选基因.根癌农杆菌抑制剂特美汀(Tim)的最佳浓度为500mg·L-1;再生芽和生根时,Hyg的最佳浓度分别为15和20 mg·L-1,Kan的最佳浓度分别为120和160 mg·L-1.对转化植株进行PCR和GUS组织化学检测,结果显示外源基因已整合到铁棍山药转基因株系的基因组中并在细胞中表达.该研究建立了一套取材便利的铁棍山药遗传转化方法,对其它品种山药的转化也具有参考价值.

通过黄独微型块茎转录组数据库筛选到SQS基因的核心片段,利用RT-PCR技术获得SQS基因保守片段,采用RACE技术获得SQS基因的3′及5′末端序列,并采用生物信息学方法进行序列分析.结果表明,黄独微型块茎SQS基因编码序列长1548 bp,编码415 bp的氨基酸序列,理论分子量为46786.38 D,等电点(pI)为5.97.SQS蛋白为疏水性蛋白,无信号肽,含有SQS所必需的功能结构域,属于Isoprenoid_Biosym_C1 superfami-ly.黄独SQS蛋白与其他植物的SQS蛋白同源性较高,其中与盾叶薯蓣的SQS蛋白氨基酸相似性为96.4％.本试验结果从黄独微型块茎中首次获得SQS基因cDNA全长序列,该基因具有SQS同源基因的典型特征,为进一步研究黄独微型块茎SQS基因结构、基因表达和基因突变提供了基础,并为薯蓣属植物三萜合成通路关键酶SQS的正选择位点与功能的关联性分析提供了数据支持.

近年来由多种致病链霉菌引起的马铃薯疮痂病在我国普遍流行,且危害程度逐年加重,严重影响块茎的品质和商品价值.病原菌土传和种传,难以防控.利用拮抗微生物抑制病菌生长是目前防控疮痂病的重要措施.[目的]从病薯田土样中定向筛选对马铃薯疮痂病具有显著防效的菌种,研究其拮抗机制,评价其环境适应性,为开发可产业化应用的高效复合功能菌剂提供理论依据.[方法]通过平板对峙及盆栽试验研究目标菌株对主要病原菌疮痂链霉菌Streptomyces scabies的抑制效果;采用形态学、生理生化实验及分子生物学方法,确定其分类地位;结合高效液相色谱质谱联用方法分析相关抑菌活性物质.[结果]获得3株对致病链霉菌S.scabies具有显著拮抗功能的菌株HZ11-4、HS-12、HZ13-1,抑菌圈直径分别为34、29、30 mm,对马铃薯微型薯疮痂病的防效分别为68.57％、57.15％和65.96％.菌体革兰氏染色呈阳性,经鉴定均为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amylolique-faciens;3株菌皆可扩增出surfactin、iturin和fengycin等脂肽类物质合成酶相关基因片段,检测到上述脂肽类抗生素的存在,其中,仅surfactin对S.scabies有一定抑制效果,但非主要活性物质.3株菌对茄链格孢菌、尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、大丽轮枝菌等多种植物病原菌均具有明显的抑制效果;可耐受pH 5-9、NaCl含量1％-7％的盐碱环境和100℃高温;对氟菌·霜霉威、氟硅唑、吡唑醚菌酯、春雷霉素、中生菌素和甲基硫菌灵等生产上常用的杀菌剂不敏感;具有显著促生长特性.[结论]HZ11-4、HS-12和HZ13-1具有良好的环境适应性和广谱抗病性,均可作为防控马铃薯土传病害功能菌剂的候选菌株.文章首次验证了脂肽类抗生素surfactin、iturin A和fengycin均非抑制S.scabies的主要活性物质.

[背景]近年来,由土传致病链霉菌引起的疮痂病在我国马铃薯产区大面积暴发,严重影响块茎的商品价值,由于缺乏有效防控措施,其危害程度呈逐年加重趋势.然而拮抗菌可有效抑制病原菌的繁殖,其防控效果优异,对环境友好,逐渐引起了人们的关注.[目的]分离筛选对致病链霉菌具有拮抗功能的细菌,鉴定其分类学名,评价其主要生物学特性,为研发高效防病菌剂提供菌种资源.[方法]以疮痂链霉菌为靶向微生物,从马铃薯疮痂病高发土样中筛选拮抗菌株,通过形态学、生理生化和分子生物学试验确定其分类地位;用盆栽试验初步判定其对马铃薯疮痂病的防控效果,研究其广谱抗病性和耐盐碱特性,结合生产中常用化学农药的敏感性测定,综合评价其应用前景.[结果]筛选出一株对致病疮痂链霉菌(Streptomyces scabies)有显著拮抗效果的菌株HD9-1,抑菌圈直径约31 mm,菌落呈圆形、淡黄色,边缘较为整齐,革兰氏染色阳性,菌体杆状,宽度约为0.75μm,长度为1.0-2.5μm.以蔗糖作为唯一碳源,能产生β-半乳糖苷酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶;培养24 h后代谢产物中含有3.44 mg/L的吲哚乙酸;16S rRNA基因序列与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RUB聚类到同一分支,确定该菌株为Bacillus subtilis;盆栽试验结果表明,HD9-1对马铃薯微型薯疮痂病的防效达59.15％;菌体可耐受pH 3.0-11.0、NaCl含量1％-11％的盐碱环境和100℃水浴30 min;对中生菌素、苯醚甲环唑、氟菌·霜霉威、春雷霉素、氟硅唑、吡唑醚、嘧菌酯和甲基硫菌灵等常用化学农药不敏感,对大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)等农作物病原菌均具有一定的抑制效果.[结论]菌株HD9-1鉴定为枯草芽孢杆菌,对马铃薯疮痂病防控效果较好,且具有良好的环境适应性,可作为防治马铃薯土传病害的高效复合菌剂的备选菌株.

基于天麻转录组数据,设计特异性引物,克隆天麻二羧酸-三羧酸载体蛋白编码基因 GeDTC,并利用 ExPASy、ClustalW、MEGA等软件对其进行生物信息学分析,利用马铃薯遗传转化体系,获得阳性转基因植株和微型薯,并对微型薯块茎的大小、质量、有机酸和淀粉含量等农艺性状进行了检测和分析,对GeDTC基因功能进行初步研究.结果显示,GeDTC开放阅读框(open reading frame)全长981 bp,编码326 个氨基酸残基,相对分子质量为35.01 kDa.预测GeDTC蛋白的理论等电点为 9.83,不稳定系数为 27.88,亲水性平均指数为 0.104,属于稳定的亲水性蛋白.GeDTC蛋白存在 1 个跨膜结构,无信号肽,定位于线粒体内膜.系统进化树显示,GeDTC与其他种类植物DTC蛋白之间具有较高的同源性,其中与铁皮石斛DcDTC(XP_020675804.1)同源性最高,为 85.89％.运用双酶切方法构建GeDTC过表达载体pCambia1300-35Spro-GeDTC,并通过农杆菌介导转化法获得了马铃薯转基因植株,移栽收获的转基因株系微型薯和野生型株系相比体积更小,质量更轻,有机酸含量低,淀粉含量无显著差异.初步推测天麻GeDTC基因可能为三羧酸的外排通道并参与调控块茎的发育,为深入阐明天麻块茎形成的分子机制奠定了基础.