目的:探讨长链非编码(lnc)RNA HCP5对胶质瘤细胞的辐射敏感性的影响及其机制。方法:分别用0、2、4、6、8 Gy射线照射胶质瘤细胞U251和U87，作为不同剂量辐射组；将si-con、si-HCP5、pcDNA、pcDNA-HCP5转染至细胞U251和U87中，分别记为si-con组、si-HCP5组、pcDNA组、pcDNA-HCP5组；将si-con、si-HCP5转染至细胞U251和U87后再用4 Gy射线照射，分别记为IR＋si-con组、IR＋si-HCP5组，仅用4 Gy射线照射的细胞记为IR组；将si-HCP5分别与anti-miR-con、anti-miR-508-3p共转染至细胞U251和U87后再用4 Gy射线照射，分别记为IR＋si-HCP5＋anti-miR-con组、IR＋si-HCP5＋anti-miR-508-3p组，转染均用脂质体法。采用RT-qPCR检测miR-508-3p和HCP5的表达；细胞克隆形成实验检测胶质瘤细胞的放射敏感性；流式细胞术检测细胞凋亡；Western blot检测磷酸化H2AX(γ-H2AX)、裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved caspase-3)、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(p-PI3K)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、蛋白激酶B(AKT)蛋白表达；双荧光素酶报告基因检测实验检测荧光活性。结果:放射处理的胶质瘤细胞HCP5高表达，miR-508-3p低表达；沉默HCP5后细胞U251和U87放射敏感性增强，细胞凋亡率升高[U251：(16.67±1.68)%，(3.58±0.62)%， t＝21.929， P<0.05；U251：(12.32±1.08)%，(4.48±0.71)%， t＝18.198， P<0.05]，γ-H2AX[U251：(0.45±0.04)，(0.23±0.05)， t＝10.307， P<0.05；U87：(0.38±0.04)，(0.24±0.03)， t＝8.400， P<0.05]、Cleaved caspase-3[U251：(0.37±0.04)，(0.16±0.03)， t＝12.600， P<0.05；U87：(0.38±0.04)，(0.22±0.03)， t＝9.600， P<0.05]表达水平升高。相比单独沉默HCP5或辐射处理，沉默HCP5同时辐射处理U251细胞，细胞凋亡率[(25.34±1.54)%，(16.67±1.68)%， t＝11.413， P<0.05；(25.34±1.54)，(11.13±1.06)， t＝22.802， P<0.05]显著升高，γ-H2AX[(0.69±0.05)，(0.45±0.04)， t＝11.245， P<0.05；(0.69±0.05)，(0.31±0.04)， t＝17.804， P<0.05]、Cleaved caspase-3[(0.52±0.06)，(0.37±0.04)， t＝6.240， P<0.05；(0.52±0.06)，(0.34±0.04)， t＝7.488， P<0.05]表达水平升高。辐射处理后且沉默HCP5后U251和U87细胞中p-PI3K[(0.21±0.02)，(0.52±0.04)， t＝20.795， P<0.05；(0.26±0.23)，(0.67±0.07)， t＝5.116， P<0.05]、p-AKT[(0.22±0.03)，(0.66±0.07)， t＝17.332， P<0.05；(0.23±0.04)，(0.71±0.03)， t＝28.800， P<0.05]表达水平降低。HCP5可靶向调节miR-508-3p表达；干扰miR-508-3p逆转了沉默HCP5和辐射对U251和U87细胞放射的增敏和促进细胞凋亡的作用，降低了γ-H2AX、Cleaved caspase-3表达水平，提高了p-PI3K、p-AKT表达水平。 结论:沉默lncRNA HCP5可增强胶质瘤细胞的辐射敏感性，促进细胞凋亡，其机制可能与miR-508-3p及PI3K/Akt信号通路有关，可为胶质瘤治疗提供新靶点和新思路。

目的 探讨环状RNA同源域相互作用蛋白激酶3(circHIPK3)与大鼠小胶质(RM)细胞活化的关系.方法 体外培养RM细胞,并随机分为正常组和氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)组,RT-qPCR检测各组细胞内circHIPK3表达水平.构建具有嘌呤霉素抗性的circHIPK3慢病毒载体,设置过表达(OE)组和阴性对照(NC)组,根据荧光表达强度选择RM细胞最佳感染复数(MOI),采用嘌呤霉素筛选稳定表达circHIPK3的RM细胞.将OE组和NC组细胞置于OGD/R条件下培养,Western blot检测各组细胞中小胶质细胞活化标志蛋白钙结合衔接分子1(Iba-1)、肿瘤坏死因子受体超家族成员5(CD40)表达水平.通过circRNAdb数据库分析circHIPK3翻译蛋白潜能,利用circBank和Starbase数据库预测circHIPK3潜在结合的微小RNA(miRNA).结果 与正常组相比,OGD/R组RM细胞中circHIPK3的表达水平显著下调(P<0.0001).测序比对结果正确,成功构建cir-cHIPK3过表达慢病毒载体.感染RM细胞最佳MOI=80,以2μg/ml嘌呤霉素筛选得到稳定过表达circHIPK3的RM细胞.RT-qPCR结果显示,OE组细胞中circHIPK3表达水平较NC组显著增高(P<0.01).Western blot结果显示,在OGD/R培养条件下,OE组细胞中Iba-1和CD40蛋白表达水平较NC组显著降低(P<0.05).蛋白翻译分析显示,cir-cHIPK3具有2个内部核糖体进入位点(IRES)和1个开放阅读框(ORF),可编码由404个氨基酸组成的多肽.miRNA结合分析显示,circHIPK3可能与8个靶向miRNAs结合:hsa-miR-3529-5p、hsa-miR-379-5p、hsa-miR-506-3p、hsa-miR-33、hsa-miR-450b-5p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-193、hsa-miR-508-3p.结论 过表达circHIPK3显著抑制OGD/R诱导的RM细胞活化、circHIPK3有编码多肽潜能,可能通过海绵miRNA发挥功能.

目的 分析绵羊肝脏及肺脏分离的细粒棘球蚴原头节(HPSC、LPSC)的微小RNA (miRNA)表达情况,筛选出寄生部位特异性miRNA,为后续miRNA生物信息学分析提供依据. 方法 从西宁市郊屠宰场采集带有包囊的新鲜绵羊肝脏、肺脏,经分离、过滤、沉淀获得棘球蚴原头节.用TRIzol法提取原头节总RNA,构建HPSC、LPSC小片段RNA (sRNA)文库,采用高通量测序技术进行深度测序,将测序获得的原始数据与miRBase、Pre-miRNA、RFam、Repbase等4个公共数据库进行比对,获得已知miRNA的注释信息.利用mfold软件预测未比对上任何注释信息的miRNA的二级结构.比较HPSC、LPSC中miRNA表达量的差异. 结果 HPSC和LPSC文库分别获得10 182 508条和11 133 735条有效序列,大部分序列长18～22 nt.其中22 nt的序列最多,分别占20.9％ (2128728/10182508)和24.6％(2737 570/11 133 735);19nt及21 nt次之,分别占14.0％(1 429846/10 182508)、18.5％ (1 880 607/10 182 508)和16.9％(1 875 698/11 133 735)、16.9％ (1 885 560/11 133 735).在HPSC和LPSC文库中,细粒棘球蚴原头节已知miRNA分别有87条和79条,新miRNA分别占341条和339条,与其他寄生虫(日本血吸虫、曼氏血吸虫、扁虫及三代虫等)保守的miRNA分别有58条和62条.在细粒棘球蚴原头节已知miRNA中,除egr-miR-36a-3p、egr-miR-36b-3p、egr-miR-10229a-5p、egr-miR-10233-5p、egr-miR-10240-3p、egr-miR-10243-5p、egr-mir-10252-5p、egr-mir-10287-5p等8个miRNA在HPSC中特异表达外,其余miRNA在2个文库均表达且表达量一致;在与其他寄生虫保守的miRNA中,有50条在HPSC和LPSC中均表达,有8条和12条分别在2个文库中特异表达.在新的miRNA中,在HPSC和LPSC文库特异表达的分别为78和76条.HPSC和LPSC文库共筛选出miRNA 574条,其中392条miRNA在2个文库中均表达,表达量居前10位的为egr-miR-1-5p、egr-miR-2a-3p、egr-miR-2c-3p、egr-miR-2b-3p、egr-miR-7-5p、egr-let-7-5p、egr-miR-7b-5p、egr-miR-9-5p、egr-miR-9-3p、egr-miR-10a-5p.LPSC与HPSC文库相比较,LPSC有124条miRNA上调2倍以上,30条miRNA下调0.5倍以下.在筛选出的miRNA中,HPSC和LPSC中分别有94条和88条特异表达. 结论 本研究发现HPSC及LPSC中存在特异表达miRNA.

目的:探讨妊娠期糖尿病(GDM)患者胎盘组织中微小RNA-508-3p(miR-508-3p)与肝细胞生长因子(HGF)的表达及两者的相互作用,初步阐明miR-508-3p介导滋养细胞胰岛素抵抗(IR)的相关分子机制.方法:选取GDM患者及正常妊娠孕产妇各15例,分别为GDM组和正常对照组.采用实时定量PCR(RT-PCR)法、免疫组织化学染色法和免疫印迹法检测2组孕产妇胎盘组织中miR-508-3p表达水平和HGF蛋白表达水平,分析两者的相关性.应用生物信息学技术筛选HGF作为miR-508-3p的目标靶基因,并通过双荧光素酶报告基因实验及免疫印迹法进行验证.体外培养人滋养细胞HTR-8/Svneo,建立HTR-8/Svneo IR细胞模型(HTR-8/Svneo-IR),采用脂质体瞬时转染法对HTR-8/Svneo-IR细胞转染miR-508-3p-inhibitor(miR-508-3p-inhibitor-IR组)和miR-NC(miR-NC-IR组),RT-PCR法检测其转染效率,免疫印迹法检测各组细胞中HGF及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路中磷酸化PI3K(p-PI3K)和磷酸化AKT(p-AKT)蛋白表达水平.结果:与正常对照组比较,GDM组患者胎盘组织中miR-508-3p表达水平明显升高(P<0.05),HGF蛋白表达水平明显降低(P<0.01),且GDM组患者胎盘组织中HGF蛋白表达水平与miR-508-3p表达水平呈负相关关系(r=-0.542,P<0.05).与HTR-8/Svneo组比较,HTR-8/Svneo-IR组细胞中miR-508-3p表达水平明显升高(P<0.05);与HTR-8/Svneo-IR组比较,miR-508-3p-inhibitor-IR组细胞中miR-508-3p表达水平明显降低(P<0.05).与HTR-8/Svneo组比较,HTR-8/Svneo-IR组细胞中HGF、p-PI3K和p-AKT蛋白表达水平均明显降低(P<0.05);与HTR-8/Svneo-IR组比较,miR-508-3p-inhibitor-IR组细胞中HGF、p-PI3K和p-AKT蛋白表达水平明显升高(P<0.05).结论:在GDM患者胎盘组织中miR-508-3p可靶向抑制HGF的表达,并通过PI3K/AKT信号通路促进滋养细胞的IR,继而参与GDM的发生发展.

目的:探讨肝细胞癌组织中microRNA(miRNA)的表达水平与肝细胞癌早期复发的相关性.方法:下载公共数据库TCGA的肝细胞癌患者临床信息、随访结果及miRNA表达情况,根据复发时间将患者分为早期复发组(≤2年复发)和晚期复发组(＞2年复发),连续变量资料采用独立样本t检验评估2组之间是否存在差异,分类变量资料采用卡方检验评估2组间是否存在差异,将单因素分析P≤0.01的指标纳入logistic多因素回归分析.结果:独立样本t检验分析显示,P≤0.01的miRNA分别为 hsa-mir-550a-1 Nhsa-mir-550a-2、hsa-mir-550a-3、hsa-mir-331、hsa-mir-514a-1、hsa-mir-210、hsa-mir-155、hsa-mir-3170N hsa-mir-4677、hsa-mir-4677、hsa-mir-508、hsa-mir-514a-3、hsa-mir-514a-2、hsa-mir-624,卡方检验显示P≤0.01 的指标为患者肿瘤T分期.Logistic 多因素回归分析显示hsa-mir-155(OR=0.660,95％CI=0.519～0.841)、hsa-mir-331(OR=1.475,95％CI=1.004～2.168)、hsa-mir-514a-1(OR =0.603,95％CI=0.413～0.879)、hsa-mir-550a-1(OR=1.680,95％CI=1.034～2.703)、肿瘤 T分期(OR=1.640,95％CI=1.126～2.389)是早期复发的独立影响因素,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:肝细胞癌组织中hsa-mir-155、hsa-mir-331、hsa-mir-514a-1、hsa-mir-550a-1的表达水平和肿瘤T分期是影响肝细胞癌术后早期复发的独立影响因素.

目的 探讨微小RNA-508-3p(miR-508-3p)在肺癌组织中的表达及其对肺癌细胞增殖活力、侵袭能力、凋亡率的影响与机制.方法 采用定量聚合酶链反应(qPCR)法和蛋白质印迹法(Western blotting)检测肺癌组织中miR-508-3p和配对盒基因2(PAX2)表达,分析两者的相关性.分别用miR-508-3p模拟物(miR-508-3p组)、模拟物阴性对照miR-NC(miR-NC组)、PAX2 siRNA si-PAX2(si-PAX2组)、siRNA阴性对照(si-NC组)、miR-508-3p抑制剂anti-miR-508-3p(anti-miR-508-3p组)、抑制剂阴性对照anti-miR-NC(anti-miR-NC组)、共转染miR-508-3p和PAX2过表达质粒pcDNA-PAX2(miR-508-3p+ pcDNA-PAX2组)、共转染miR-508-3p和空白质粒pcDNA-NC(miR-508-3p+ pcDNA-NC组)转染肺癌A549细胞,并设置空白组.采用噻唑蓝(MTT)法检测24 ～72 h的细胞增殖活力;采用Transwell小室及流式细胞术分别检测细胞侵袭能力及凋亡率,采用Western blotting检测A549细胞基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达.根据双荧光素酶活性检测结果评估miR-508-3p对PAX2的靶向调控.结果 肺癌组织miR-508-3p表达低于癌旁组织,PAX2 mRNA和PAX2蛋白表达高于癌旁组织,差异有统计学意义(P＜0.05);PAX2蛋白和miR-508-3p的表达呈显著负相关(P＜0.05).与空白组比较,miR-508-3p组Bax表达和细胞凋亡率均升高,MMP-2、Bcl-2蛋白表达和增殖活力、侵袭能力均降低,差异有统计学意义(P＜0.05);与si-NC组比较,si-PAX2组PAX2、MMP-2、Bcl-2表达降低,Bax表达、凋亡率升高,增殖活力和侵袭能力降低,差异有统计学意义(P＜0.05).miR-508-3p靶向PAX2基因,调控PAX2蛋白的表达.PAX2可以逆转miR-508-3p对A549细胞增殖活力、侵袭能力以及细胞凋亡的影响.结论 miR-508-3p在肺癌组织低表达,其过表达可降低A549细胞增殖活力及侵袭能力,诱导细胞凋亡,机制与靶向调控PAX2基因有关.