基于聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)的悬浮人胚胎肾细胞(human embryonic kidney 293 cells,HEK293)转染技术前景广阔,但培养基组分会影响转染效率.简单的离心换液存在污染风险,且影响细胞状态.探究抑制转染效率的关键组分对转染过程的影响机制,有利于从根本上解决该问题.首先通过探究培养基中对转染效率具有潜在影响的组分确定关键组分柠檬酸铁铵(ferric ammonium citrate,FAC)的抑制作用,然后通过考察柠檬酸铁铵添加对细胞状态、PEI与DNA形成的复合物(PEI-DNA complex,PEI-DNA复合物)结合情况、目的基因表达情况的影响,分析其抑制转染效率的机制.结果表明,高浓度的柠檬酸铁铵对细胞转染存在明显抑制作用,且该抑制作用随着柠檬酸铁铵浓度的升高而逐渐增强.当柠檬酸根和铁离子同时存在时才会抑制细胞转染过程.过高浓度的柠檬酸铁铵使PEI-DNA复合物的粒径显著增加,复合物进入细胞更加困难,导致进入细胞的复合物数量减少,最终引起细胞转染效率的大幅下降.柠檬酸铁铵通过影响PEI-DNA复合物的大小限制DNA进入细胞,从而抑制PEI介导的悬浮HEK293 细胞转染过程.控制转染时柠檬酸铁铵浓度在 20 μmol/L内可解决其对转染过程的抑制作用.本研究深入认识了柠檬酸铁铵对PEI介导的悬浮HEK293 细胞转染过程的影响及其机制,为悬浮HEK293 细胞转染培养基的开发和理性设计提供有力参考.

目的 真核表达、纯化人IgE重链恒定区2～4区(IgECε2-4)蛋白,利用表面等离子体共振技术(SPR)捕获其相互作用蛋白.方法 构建3个含不同信号肽序列的IgECε2-4重组真核表达载体,分别瞬时转染HEK293FT悬浮细胞,优化选用表达量最高的重组质粒进行大量瞬转表达,镍柱亲和层析纯化.免疫荧光技术鉴定重组蛋白与KU812细胞表面IgE受体FcεR I的结合,采用SPR技术捕捉人血清中与IgECε2-4相互作用的蛋白.结果 含信号肽3(SP3)的重组质粒表达量最高,表达量约为6.2 mg/L;亲和纯化获得高纯度的人IgECε2-4蛋白;免疫荧光技术鉴定显示重组蛋白IgECε2-4可与KU812细胞表面受体结合.通过SPR技术捕获到人血清中39种可能与IgECε2-4结合的蛋白.结论 获得纯化的重组蛋白IgECε2-4,IgECε2-4能与KU812细胞表面FcεR1α受体结合,靶标垂钓结果显示IgECε2-4能与人血清中的39种蛋白存在相互作用或有间接结合作用.

该研究通过慢病毒感染的方式构建携带T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3及可结晶区域[T cell immunoglobulin and mucin domain 3 and fragment of crystallizable,TIM-3(Fc)]目的基因的稳定转染细胞株并检测TIM-3(Fc)分泌蛋白的表达.设计特异性引物PCR扩增TIM-3 (Fc)片段,重组插入慢病毒表达载体pCD513中并鉴定阳性克隆,无内毒素提取质粒pCD513-TIM-3(Fc)、pSPAX2和pMD2.G共转染293T细胞包装慢病毒,再利用慢病毒感染悬浮HEK293细胞,最后通过嘌呤霉素筛选得到稳定转染细胞株293/TIM-3.再通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot, WB)检测TIM-3(Fc)目的基因在转录和翻译水平上的表达,用时间分辨免疫荧光技术(TRFIA)检测细胞产生TIM-3(Fc)分泌蛋白的能力.成功构建了pCD513-TIM-3(Fc)慢病毒表达载体,qRT-PCR、WB和TRFIA检测表明,293/TIM-3细胞株成功表达了TIM-3(Fc)分泌蛋白.成功构建了重组人可溶性TIM-3稳定转染细胞株293/TIM-3并成功表达了TIM-3(Fc)分泌蛋白,为进一步研究可溶性TIM-3蛋白的生物学功能提供基础.

目的:设计并制备抗GPC3/CD3双特异性重链抗体(BiHcAb),分析其与双特异性T细胞衔接子(BiTE)在体内外抗肿瘤活性的差异.方法:通过全基因合成抗GPC3和抗CD3单域抗体(sdAb)序列,克隆至携带IgG4 Fc段的表达载体中,同时利用KIH技术形成稳定的双特异性重链抗体.2种质粒共转染HEK-293F细胞,悬浮摇瓶培养获得目的抗体.SDS PAGE和考马斯亮蓝染色确定相对分子质量.通过流式细胞术检测与GPC3阳性肿瘤细胞和外周血单个核细胞(PBMC)的结合能力.通过共培养检测BiHcAb介导的细胞杀伤效果及细胞因子释放;采用裸鼠异体移植模型实验检测BiHcAb的体内抑制肿瘤活性.结果:成功构建并表达抗GPC3/CD3 BiHcAb,相对分子质量约为100000,BiTE相对分子质量约为50000.抗GPC3/CD3 BiHcAb较BiTE对表达GPC3的肿瘤细胞具有更强的杀伤活性,同时促进释放更多的细胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6),差异有统计学意义(P＜0.05).裸鼠体内实验显示抗GPC3/CD3 BiHcAb比BiTE具有更强的体内抑制肿瘤生长的作用,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:成功制备的抗GPC3/CD3 BiHcAb较BiTE在体内外具有更强的抗肝癌作用.

目的 探讨miR-185在弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)细胞黏附介导耐药(cell adhesion mediated-drug resistance,CAM-DR)中的作用.方法 采用qPCR法分析人DLBCL细胞株OCI-Ly8、OCI-Ly10中miR-185的表达.应用Western blot法检测人DLBCL细胞株OCI-Ly8、OCI-Ly10中PYK2和pPYK2(Tyr402)的表达状态.在人胚肾HEK-293T细胞中利用荧光素酶报告基因实验分析miR-185是否可靶向抑制PYK2.台盼蓝拒染实验分析miR-185和PYK2对CAM-DR的影响.结果 qPCR检测发现,OCI-Ly8与纤连蛋白(fibronectin,FN)黏附培养组与悬浮培养组中miR-185的表达:(0.17±0.07)vs(1.01±0.11)(t=9.05,P<0.001);OCI-Ly10细胞与FN黏附培养组与悬浮培养组中miR-185的表达:(0.35±0.15)vs(1.01±0.15)(t=4.50,P=0.011);提示OCI-Ly8及OCI-Ly10细胞与FN黏附培养可下调miR-185的表达.Western blot法检测发现,OCI-Ly8及OCI-Ly10细胞与FN黏附培养可上调PYK2总蛋白及pPYK2(Tyr402)表达水平.在悬浮及FN黏附培养状态下,敲低miR-185可上调PYK2总蛋白及pPYK2(Tyr402)表达水平.在HEK-293T细胞中过表达miR-185后,3′非翻译区(untranslated region,UTR)空载体组与野生型PTK2B 3′UTR组的相对荧光素酶报告基因活性:(1.00±0.06)vs(0.49±0.04)(t=9.54,P<0.001);3′UTR空载体组与突变型PTK2B 3′UTR组的相对荧光素酶报告基因活性:(1.00±0.06)vs(0.94±0.06)(t=1.01,P=0.371);提示miR-185可靶向抑制PYK2.台盼蓝拒染实验显示,OCI-Ly8细胞黏附培养状态下shCtrl(对照慢病毒)+Doxo(多柔比星)组与sh-miR-185(miR-185下调慢病毒)+Doxo组细胞死亡比例:(39.43±3.94)％vs(26.93±6.25)％(t=2.93,P=0.043);OCI-Ly10细胞黏附培养状态下shCtrl+Doxo组与sh-miR-185+Doxo组细胞死亡比例:(43.67±9.66)％vs(16.10±3.42)％(t=4.66,P=0.009).OCI-Ly8细胞黏附培养状态下Ctrl(对照慢病毒)+Doxo组与PYK2(PYK2过表达慢病毒)+Doxo组细胞死亡比例:(37.70±7.64)％vs(20.07±7.59)％(t=2.84,P=0.047);OCI-Ly10细胞黏附培养状态下Ctrl+Doxo组与PYK2+Doxo组细胞死亡比例:(34.00±5.46)％vs(14.37±3.46)％(t=5.26,P=0.006).细胞黏附介导的miR-185下调和PYK2表达增加,可促进CAM-DR.OCI-Ly8细胞黏附培养状态下sh-miR-185+Doxo组与sh-miR-185+Doxo+PF-562271组细胞死亡比例:(25.03±3.30)％vs(39.37±5.06)％(t=4.11,P=0.015);OCI-Ly10细胞黏附培养状态下sh-miR-185+Doxo组与sh-miR-185+Doxo+PF-562271组细胞死亡比例:(27.50±6.52)％vs(47.53±9.43)％(t=3.03,P=0.039);PF-562271可抑制miR-185下调介导的CAM-DR表型.结论 DLBCL细胞与FN黏附培养可下调miR-185表达,并上调PYK2总蛋白及pPYK2(Tyr402)表达水平;在DLBCL中miR-185可靶向抑制PYK2,细胞黏附介导的miR-185下调可能通过诱导PYK2表达增加促进CAM-DR;PF-562271可抑制miR-185下调介导的CAM-DR.

目的·利用Crispr/Cas9基因编辑技术在人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)中探索小分子多肽ELABELA(ELA)是否存在潜在的新受体.方法·收集干细胞向心肌细胞定向分化过程中不同天数(0～13d)的细胞,检测其ELA及其受体APJ的动态表达水平.在干细胞向心肌细胞定向分化过程中加入APJ抑制剂ML221,观察心肌细胞标志物MYH6、TnnT2及NKX2.5的mRNA表达水平是否发生变化.利用人胚肾悬浮细胞(HEK-293F)表达重组ELA绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP),研究ELA发挥结合作用的区域在其C末端还是N末端,构建GFP序列分别插入ELA-32序列的C末端及N末端的2种重组质粒.利用Crispr/Cas 9基因编辑技术构建ELA唯一已知受体APJ敲除的hESC并进行验证.在构建成功的敲除细胞系及正常细胞系中外源性加入2种GFP-ELA重组蛋白,通过荧光显微镜观察ELA是否能够进入细胞.结果·在干细胞向心肌细胞定向分化过程中,在干细胞时期,ELA高表达而APJ低表达;ELA表达高峰在分化第6天而APJ表达高峰出现在分化第3天.外源性加入APJ抑制剂ML221后,MYH6、TnnT2及NKX2.5的mRNA表达水平无显著变化(P＞0.05).经过基因DNA测序及Western blotting验证,成功构建敲除APJ干细胞系.敲除APJ后,外源性加入ELAN端荧光蛋白,仍能够进入细胞内;而ELAC端荧光蛋白未出现荧光,表示ELA C端荧光蛋白不能进入细胞.结论·hESC中存在非APJ的ELA其他受体,ELA与受体发生结合的部位主要位于C末端.