目的 建立稳定的小鼠肝脏原代细胞同步分离技术,研究铁超载对肝脏原代细胞凋亡的影响.方法 通过胶原酶消化、percoll密度梯度离心和CD146磁珠分选等步骤,同步分离纯化小鼠肝实质细胞、肝窦内皮细胞和枯否细胞,并使用流式细胞术、免疫荧光染色等鉴定细胞类型.体外培养各类型细胞,使用0、25、50、100 μmol/L的柠檬酸铁铵刺激24 h建立铁超载模型,通过普鲁士蓝染色观察细胞铁含量,流式细胞术测定细胞存活率和线粒体膜电位水平.结果 肝脏原代细胞同步分离技术效率稳定,肝实质细胞得率为(4.0±0.5)×107细胞/只,存活率为(76.33±0.67)％;肝窦内皮细胞得率为(5.0±1.0)×106细胞/只,存活率和纯度分别为(93.63±0.25)％和(93.40±0.46)％;枯否细胞得率为(1.5±0.5)×106细胞/只,存活率和纯度分别为(98.33±0.12)％和(88.30±2.02)％.获得的细胞数量多、活力好、纯度高,能满足后续实验要求.与空白对照组相比,柠檬酸铁铵处理的3种类型细胞中铁含量显著增加.在柠檬酸铁铵的刺激下,肝实质细胞的存活率从(73.97±5.54)％下降至(54.10±1.68)％,JC-1聚合物平均荧光强度从326.33±30.37下降至155.00±6.56,JC-1单体平均荧光强度从1700.00±144.04上升至3713.33±81.82;肝窦内皮细胞的存活率从(90.60±1.74)％下降至(78.03±2.15)％,JC-1聚合物平均荧光强度从502.33±5.51下降至372.33±4.04,JC-1单体平均荧光强度从750.00±67.51上升至1340.00±36.39;枯否细胞的存活率从(94.23±1.44)％下降至(88.37±1.56)％,JC-1聚合物平均荧光强度从652.67±25.66下降至478.00±12.49,JC-1单体平均荧光强度从1984.33±80.65上升至3062.33±245.20.结论 建立了稳定的小鼠肝脏原代细胞同步分离技术,并证实铁超载可增加肝实质细胞、肝窦内皮细胞和枯否细胞的凋亡.

基于聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)的悬浮人胚胎肾细胞(human embryonic kidney 293 cells,HEK293)转染技术前景广阔,但培养基组分会影响转染效率.简单的离心换液存在污染风险,且影响细胞状态.探究抑制转染效率的关键组分对转染过程的影响机制,有利于从根本上解决该问题.首先通过探究培养基中对转染效率具有潜在影响的组分确定关键组分柠檬酸铁铵(ferric ammonium citrate,FAC)的抑制作用,然后通过考察柠檬酸铁铵添加对细胞状态、PEI与DNA形成的复合物(PEI-DNA complex,PEI-DNA复合物)结合情况、目的基因表达情况的影响,分析其抑制转染效率的机制.结果表明,高浓度的柠檬酸铁铵对细胞转染存在明显抑制作用,且该抑制作用随着柠檬酸铁铵浓度的升高而逐渐增强.当柠檬酸根和铁离子同时存在时才会抑制细胞转染过程.过高浓度的柠檬酸铁铵使PEI-DNA复合物的粒径显著增加,复合物进入细胞更加困难,导致进入细胞的复合物数量减少,最终引起细胞转染效率的大幅下降.柠檬酸铁铵通过影响PEI-DNA复合物的大小限制DNA进入细胞,从而抑制PEI介导的悬浮HEK293 细胞转染过程.控制转染时柠檬酸铁铵浓度在 20 μmol/L内可解决其对转染过程的抑制作用.本研究深入认识了柠檬酸铁铵对PEI介导的悬浮HEK293 细胞转染过程的影响及其机制,为悬浮HEK293 细胞转染培养基的开发和理性设计提供有力参考.

目的 探讨不同浓度柠檬酸铁铵(FAC)对体外培养的大鼠皮质神经干细胞(NSCs)细胞活力和分化率影响.方法 体外培养胚胎14~15 d的皮质NSCs;应用CCK-8细胞增殖和毒性检测试剂盒检测经FAC处理后NSCs细胞活力的改变,免疫荧光染色检测Nestin、β-tubulinⅢ 和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞,Western Blot检测NSCs的 β-tubulinⅢ 和GFAP蛋白表达水平.结果 分离培养的皮质NSCs能增殖形成神经球,且经分化培养基诱导后可分化为 β-tubulinⅢ 或GFAP阳性的细胞.不同浓度(10~100 mg/L)的FAC均可降低细胞活力(F=55.86,q=9.154~15.880,P<0.01).不同浓度的FAC不影响NSCs的 β-tubulinⅢ 和GFAP蛋白表达水平(P>0.05).结论 FAC可降低皮质NSCs细胞活力,但不影响NSCs向神经元和星形胶质细胞的分化比例.

目的 研究硝苯吡啶对HK-2细胞铁超载引起的氧化应激的作用和可能的机制.方法 HK-2细胞分成空白组、铁超载组、硝苯吡啶组和共处理组,用柠檬酸铁铵和(或)硝苯吡啶处理细胞24 h后检测细胞丙二醛(MDA)含量、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性,谷胱甘肽(GSH)含量,细胞内铁含量以及二价金属离子转运蛋白1(DMT1)和膜铁转运蛋白1(FPN1)的表达.结果 与铁超载组相比硝苯吡啶组和共处理组MDA含量降低(P<0.05),T-SOD活性增加(P<0.05),GSH含量增加(P<0.05),细胞内铁含量降低(P<0.05),DMT1表达增加(P<0.05),FPN1表达增加(P<0.05).结论 硝苯吡啶在铁超载HK-2细胞的氧化应激中有保护作用,这一作用与硝苯吡啶促进DMT1和FPN1的表达、降低细胞内铁含量有关.

本文旨在研究巨噬细胞极化过程对自身铁代谢调节的影响.用20 ng/mLγ干扰素(interferon gamma,1FN-γ)刺激猪肺泡巨噬细胞(3D4/2细胞)24 h,诱导其为M1型巨噬细胞,另外用10 ng/mL白细胞介素4(interleukin-4,IL-4)联合10 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF)共同刺激3D4/2细胞24 h,诱导其为M2型巨噬细胞,用实时定量PCR、免疫荧光染色法和Western bolt检测巨噬细胞炎症因子和铁代谢相关蛋白的表达.收集M1/M2型巨噬细胞培养液上清液与猪肠上皮IPEC-J2细胞共培养,用CCK-8法检测IPEC-J2的增殖能力.给M1/M2型巨噬细胞外源添加柠檬酸铁铵(ammonium ferric citrate,FAC),用异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖(fluorescein isothiocyanate-dextran,FITC-dextran)及流式细胞术检测3D4/2细胞吞噬能力.结果 显示,和对照组相比,M1型巨噬细胞铁调素、铁蛋白重链、轻链和脂质运载蛋白-2 mRNA表达水平上调,胞内铁含量增加,显示出铁保留的表型,并且铁可增强M1型巨噬细胞的吞噬能力;M2型巨噬细胞上述基因mRNA表达水平无显著变化,而铁转运蛋白和转铁蛋白受体mRNA表达水平上调,胞内铁含量减少,显示出铁释放的表型,并且其培养液上清液能促进IPEC-J2细胞增殖.上述结果提示,M1型巨噬细胞倾向于将铁保留在细胞内,减少胞外铁含量,从而抑制胞外菌的增殖;而M2型巨噬细胞倾向于释放铁,有助于周围细胞的增殖,从而促进组织修复.

该研究探究铁过载对Wnt信号诱导的小鼠骨髓基质细胞(ST2)成骨分化的作用及其可能的机制.采用柠檬酸铁铵(FAC)模拟铁过载微环境,用碱性磷酸酶(ALP)染色及生化定量检测成骨分化水平,qRT-PCR检测成骨分化标志基因Alp、Runx2、Osx、Coll以及Wnt信号靶基因Smad6、CyclinD1、Lef1、BMP4的mRNA表达水平,免疫荧光法检测β-catenin入核情况.结果显示,铁过载剂量依赖性抑制Wnt信号诱导的ST2成骨分化,同时显著降低Wnt信号诱导的成骨分化标志基因及Wnt信号靶基因的表达(P＜0.05),且铁过载抑制Wnt信号诱导的β-catenin入核.综上所述,铁过载抑制Wnt信号诱导的ST2细胞成骨基因和Wnt靶基因的表达,并通过抑制β-catenin入核而抑制ST2细胞成骨分化.

目的 观察铁过载对小鼠心脏功能及大鼠心肌细胞铁死亡的影响,探讨铁转运蛋白受体(TFRC)在大鼠心肌细胞铁死亡中的作用机制.方法 C57BL/6J小鼠14只,随机分为正常饮食组和高铁饮食组各7只,分别给予常规饲料和高铁饲料喂食8周后,采用小动物超声检测其心脏功能,酶标仪检测心脏组织丙二醛(MDA)含量,Masson染色检测心脏纤维化情况.通过碘化丙啶(PI)染色和亲脂荧光染料(C11)染色检测细胞死亡率和脂质过氧化物含量,观察柠檬酸铁铵(AIC)和铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)对H9C2大鼠心肌细胞的作用.AIC和铁死亡诱导剂Erastin处理H9C2细胞后,Western blotting检测TFRC、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)蛋白表达水平,qRT-PCR检测mRNA表达水平;相同条件下,小干扰RNA敲低TFRC的表达,检测H9C2细胞死亡率和脂质过氧化物含量.结果 与正常饮食组比较,高铁饮食组小鼠心室间隔厚度(IVSd)、左心室后壁厚度(LVPWd)、心脏组织MDA相对含量和胶原沉积相对面积均明显增大[(0.96±0.12)mm vs.(0.73±0.09)mm,(1.18±0.28)mm vs.(0.84±0.07)mm,2.08±0.80 vs.1.00±0.50,4.04±0.60 vs.1.00±0.21,P<0.05],但左室射血分数和左心室缩短分数差异无统计学意义(P>0.05).经500μmol/L AIC处理后,H9C2细胞死亡率和脂质过氧化物含量明显升高(33.73％±1.20％vs.2.30％±1.73％,5.36±0.06 vs.1.00±0.19,P<0.05),加用Fer-1处理后H9C2细胞死亡率和脂质过氧化物含量明显降低(19.63％±0.81％vs.33.73％±1.2％,2.03±0.12 vs.5.36±0.06,P<0.05);500μmol/L AIC处理后,H9C2细胞TFRC表达量明显升高(P<0.05),TFRC敲低后,脂质过氧化物含量和细胞死亡率明显下降(P<0.05).Erastin诱导下H9C2细胞TFRC和GPX4蛋白表达量分别明显上调和下调(P<0.05);TFRC敲低后,细胞死亡率明显下降(P<0.05).结论 高铁饮食可诱导大鼠心肌细胞发生铁死亡损伤,TFRC参与了高铁诱导的心肌细胞铁死亡并可能成为心脏疾病治疗研究的新靶点.

目的:探讨不同浓度柠檬酸铁铵对骨缺损大鼠缺损区骨愈合作用的影响.方法:将不同浓度的柠檬酸铁铵(0、5、50 mg/kg,3 d)通过腹腔注射方式作用于实验大鼠,连续注射9周.ELISA法检测骨缺损大鼠血清,HE和Masson染色法检测骨缺损大鼠缺损区骨小梁,免疫组织化学法检测骨缺损大鼠缺损区新生骨小梁,Micro-CT检测骨缺损大鼠缺损区骨愈合程度.结果:与对照组相比,低浓度柠檬酸铁铵组大鼠血清SI含量升高,骨形成相关蛋白OCN、PINP含量升高,骨吸收相关蛋白CTX-I含量降低,骨缺损区骨小梁较多,新生骨小梁含量较高,骨愈合程度较高(P<0.05).与对照组相比,高浓度柠檬酸铁铵组大鼠血清SI含量升高,骨形成相关蛋白OCN、PINP含量降低,骨吸收相关蛋白CTX-I含量升高,大鼠骨缺损区骨小梁较少、新生骨小梁含量降低,骨愈合程度较低(P<0.05).结论:低浓度柠檬酸铁铵可以通过促进骨小梁新生,进而促进骨缺损大鼠缺损区的骨愈合.高浓度柠檬酸铁铵可通过抑制骨小梁新生,进而抑制骨缺损大鼠缺损区的骨愈合.

目的 探讨维生素D(vitamin D,VD)与铁联合对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)所致的结肠炎性细胞的影响及作用机制.方法 将SW480细胞随机分为对照组(control),模型组(model,1μg/ml LPS),25(OH)D3干预组[1 p g/ml LPS+500 ng/ml 25(OH)D3],铁干预组[1 μ g/ml LPS+1 mmol/L 柠檬酸铁铵(ferric ammonium citrate,FAC)],联合干预组[1μg/ml LPS+500 ng/ml25(OH)D3+1 mmol/L FAC],干预24h后收集细胞,免疫荧光检测各组细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;酶联免疫吸附试剂 盒(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞IL-6、TNF-α、1,25(OH)2D3水平;western blots法检测各组细胞p38、p-p38、CYP27B1和CYP24A1蛋白表达水平.结果 与对照组相比,模型组的ROS、IL-6和TNF-α 水平明显增加(P＜0.05),p38蛋白磷酸化水平也明显增加(P＜0.05),CYP27B1蛋白表达水平增加,CYP24A1表达降低,25(OH)D3+FAC联合干预组的1,25(OH)2D3水平增加(P＜0.05);与模型组比较,25(OH)D3+FAC联合干预组的ROS、IL-6和TNF-α 水平明显降低(P＜0.05),p38蛋白磷酸化水平与CYP27B1蛋白表达明显降低(P＜0.05),CYP24A1表达增加.结论 维生素D与铁联合能够有效降低LPS所致的结肠炎性细胞的炎症水平,该过程可能是由p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路介导的.

目的 探讨右美托咪定(Dex)对柠檬酸铁铵(FAC)诱导的小鼠海马神经元细胞(HT22)铁超载毒性的保护作用及相关机制.方法 选取状态良好的HT22细胞随机分为4组:对照组(Ctrl组)、FAC处理组(FAC组)、Dex处理组(Dex组)、铁死亡抑制剂Fer-1处理组(Fer-1组).采用FAC诱导细胞制备铁超载模型.随后采用CCK-8法检测HT22细胞的增殖存活率;Western blot检测铁死亡标志性蛋白前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、长链酯酰辅酶A合成酶4(ACSL4)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、转铁蛋白受体1(TFR1)及膜铁输出蛋白(Fpn)的蛋白表达;qPCR检测HT22细胞内PTGS2和ACSL4的基因表达水平;DHE荧光探针检测HT22细胞内的活性氧簇(ROS)水平;MDA检测试剂盒检测HT22细胞内脂质氧化水平;Mito-FerroOrange—亚铁离子探针检测HT22细胞内Fe2+水平;电镜检测细胞内超微结构的改变.结果 Dex组和Fer-1组预处理2 h后细胞死亡率明显下降,铁死亡标志物PTGS2和ACSL4蛋白表达和基因表达水平显著降低,细胞超微结构损坏程度明显改善,ROS、脂质氧化以及Fe2+的水平明显低于FAC组(P<0.05).结论 Dex预处理可以减轻FAC诱导的HT22细胞铁超载毒性损伤,与其可能抑制铁死亡有关.