基于聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)的悬浮人胚胎肾细胞(human embryonic kidney 293 cells,HEK293)转染技术前景广阔,但培养基组分会影响转染效率.简单的离心换液存在污染风险,且影响细胞状态.探究抑制转染效率的关键组分对转染过程的影响机制,有利于从根本上解决该问题.首先通过探究培养基中对转染效率具有潜在影响的组分确定关键组分柠檬酸铁铵(ferric ammonium citrate,FAC)的抑制作用,然后通过考察柠檬酸铁铵添加对细胞状态、PEI与DNA形成的复合物(PEI-DNA complex,PEI-DNA复合物)结合情况、目的基因表达情况的影响,分析其抑制转染效率的机制.结果表明,高浓度的柠檬酸铁铵对细胞转染存在明显抑制作用,且该抑制作用随着柠檬酸铁铵浓度的升高而逐渐增强.当柠檬酸根和铁离子同时存在时才会抑制细胞转染过程.过高浓度的柠檬酸铁铵使PEI-DNA复合物的粒径显著增加,复合物进入细胞更加困难,导致进入细胞的复合物数量减少,最终引起细胞转染效率的大幅下降.柠檬酸铁铵通过影响PEI-DNA复合物的大小限制DNA进入细胞,从而抑制PEI介导的悬浮HEK293 细胞转染过程.控制转染时柠檬酸铁铵浓度在 20 μmol/L内可解决其对转染过程的抑制作用.本研究深入认识了柠檬酸铁铵对PEI介导的悬浮HEK293 细胞转染过程的影响及其机制,为悬浮HEK293 细胞转染培养基的开发和理性设计提供有力参考.

目的 构建miR194-5p慢病毒表达载体pMSCV-PIG-miR194-5p,应用包装后产生的慢病毒感染Stra8-GC1-spg细胞,获得稳定过表达miR194-5p精原细胞株.方法 用PCR法扩增miR194-5p的前体序列pri-miR194-5p.利用分子克隆技术构建慢病毒表达载体pMSCV-PIG-miR194-5p.将其与Gag pol和VSV.G辅助质粒一起用PEI法共转染至293T包装细胞内,收集慢病毒上清,后将其感染Stra8-GC1-spg细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定过表达miR194-5p的精原细胞株.结果 构建了慢病毒重组质粒pMSCV-PIG-miR194-5p.经酶切鉴定及DNA测序法证实序列准确无误.经包装产生的慢病毒能成功感染Stra8-GC1-spg细胞,并稳定过表达miR194-5p.结论 成功地构建了慢病毒表达重组质粒pMSCV-PIG-miR194-5p,经包装后产生预计的慢病毒,建立了稳定过表达miR194-5p的精原细胞株.

目的:白细胞介素(IL)-33具有重要的免疫调控作用,在疾病中扮演着重要的角色.本文旨在通过基因优化实现IL-33在哺乳动物细胞中的高效表达,为疾病机理研究以及疫苗免疫佐剂应用等提供基础.方法:根据小鼠白细胞介素-33成熟肽(mIL-33)的氨基酸序列,以哺乳动物细胞基因表达密码子偏好性进行基因优化设计;化学合成优化的mIL-33基因片段,通过搭桥PCR将编码人CD8α信号肽的核酸序列分别与优化或未优化的mIL-33基因连接,并与绿色荧光蛋白(EGFP)基因分别构建到双表达单元质粒pBudCE4.1的不同启动子下;重组质粒经lipofectamine 3000和PEI转染293FT细胞;以Westem blot和ELISA检测重组蛋白的表达;收集表达的mIL-33刺激巨噬细胞Raw264.7,ELISA检测培养上清的TNFα水平,以证明IL-33的生物学活性.结果:重组质粒经酶切鉴定及测序分析证实构建成功;lipofectamine 3000转染效率较PEI转染更高;Western blot和ELISA结果显示密码子优化的mIL-33表达水平较未优化序列更高,在EF-1α启动子和CMV启动子指导下mIL-33在293FT细胞表达水平相当,CD8α信号肽成功引导mIL-33的分泌,产物具生物学活性.结论:密码子优化操作显著改善了mIL-33在哺乳动物细胞中的表达水平,为进一步研究奠定了基础.

目的 探讨载miR-206微泡联合超声靶向微泡破坏技术(UTMD)对宫颈癌生长的影响及作用机制.方法 以磷脂复合物为原料,PEI-600修饰微泡改变表面电荷,采用薄膜水化法和机械振荡法制备载基因微泡,激光共聚焦显微镜和扫描电镜及粒度分析仪检测表征;构建U14宫颈癌皮下移植瘤模型,分为空白对照(control)组、MB+US组、miR-206 MB+US组;各组给予相应干预,绘制肿瘤生长曲线,治疗结束后处死小鼠并称取瘤重,计算肿瘤体积抑瘤率和重量抑瘤率,取肿瘤组织行苏木素-伊红(HE)染色观察组织形态变化,行免疫组织化学检测肝细胞生长因子受体(C-Met)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、雷帕霉素靶体蛋白(mTOR)的表达,行RT-PCR检测miR-206含量.结果 治疗第3～11天,MB+US组及miR-206-MB+US组肿瘤大小均显著小于control组,且miR-206-MB+US组显著小于MB+US组(P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001).治疗结束后MB+US组和miR-206 MB+US组的体积抑瘤率分别为(45.63±2.59)％、(85.59±16.05)％,重量抑瘤率分别为(8.56±1.68)％、(74.71±1.81)％,两组比较差异均有统计学意义(P＜0.001).miR-206 MB+US组C-Met、p-Akt、mTOR表达均显著低于MB+US组及control组(P＜0.05,P＜0.01);MB+US组p-Akt表达显著低于control组(P＜0.05).结论 微泡联合UTMD是一种新型的体内基因转染方法,该方法能够有效介导miR-206抑制宫颈癌生长,可能与C-Met/p-AKT/mTOR信号通路有关.

目的 探究经聚醚酰亚胺(polyetherimide,PEI)表面修饰后的纳米羟基磷灰石载体介导脑源性神经营养因子(derived neurotrophic factor,BDNF)体外转染效率,表达产物对庆大霉素所致小鼠耳蜗螺旋神经节细胞(spiral ganglion cells,SGCs)细胞损伤的保护作用.方法 构建经PEI表面修饰的纳米羟基磷灰石载体和BDNF基因真核表达质粒,体外培养并转染小鼠耳蜗SGCs细胞;分别采用实时定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)、蛋白质免疫印迹和细胞计数试剂盒kit-8(cell counting kit-8,CCK-8)细胞毒实验,检测体外培养小鼠耳蜗SGCs细胞及纳米羟基磷灰石载体介导BDNF基因的体外转染及表达效率,对耳毒性药物庆大霉素所致SGCs细胞损伤的保护作用.结果 DNA核酸电泳结果显示成功构建带有巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)启动子的BDNF真核表达质粒;qRT-PCR和蛋白质免疫印迹结果显示与转染空质粒对照组相比,转染BDNF表达载体构建后SGCs原代细胞中BDNF的mRNA水平显著上调4.19倍(t=5.744,P<0.05),蛋白水平显著上调3.03倍(t=6.627,P<0.05),差异有统计学意义.此外,蛋白质免疫印迹和CCK8细胞毒实验结果表明,庆大霉素处理可显著抑制小鼠耳蜗SGCs细胞内BDNF基因表达,加剧细胞毒性,转染纳米羟基磷灰石载体介导qRT-PCR BDNF基因可明显逆转庆大霉素对SGCs的细胞毒作用,差异有显著统计学意义(t=10.015,P<0.01).结论 经PEI表面修饰的纳米羟基磷灰石载体可显著增强BDNF基因的跨膜能力,显著上调SGC细胞内BDNF表达产物的表达及对庆大霉素所致SGCs细胞损伤的保护作用,为内耳基因治疗的临床开展及应用提供实验和理论依据.

目的:探讨慢病毒介导Gag-caspase-8对小鼠乳腺癌4T1细胞BALB/C移植瘤的抑制效果.方法:PEI转染法将Gag-caspase-8转入293T细胞包装,并收集病毒颗粒.BALB/C小鼠建立4T1乳腺癌移植瘤模型,按照数字表法随机分为对照组(注射等量PBS)、Gag-caspase-8治疗组(注射1×106/mL Gag-caspase-8)和Gag组(注射1×106/mL Gag).在种植细胞第10天开始经瘤内注射Gag-caspase-8进行抑瘤实验,每只0.1 mL,每3 d给药1次,共计3次,观察小鼠移植瘤的生长情况;抑瘤实验第12天处死小鼠,采用免疫荧光法检测移植瘤组织caspase-8蛋白表达.结果:抑瘤实验12 d时,对照组、Gag组移植瘤体积明显高于Gag-caspase-8组,Gag-caspase-8组抑瘤率明显高于对照组,差异有统计学意义.Gag-caspase-8组Caspase-8蛋白表达高于对照组和Gag组,Gag-caspase-8组肺部转移结节数明显少于对照组,差异有统计学意义.结论:Gag-caspase-8慢病毒颗粒对小鼠乳腺癌荷瘤生长及肺转移有抑制作用.

目的 构建以介孔硅为基础的姜黄素(curcumin,CUR)-siRNA共递送系统,探讨其对巨噬细胞向M2型极化的促进作用.方法 采用常规溶胶-凝胶法制备介孔硅纳米粒(mesoporous silica nanoparticles,MSN),在其内部孔道吸附小分子CUR,外层吸附阳离子高分子聚乙烯亚胺(polymeric polyethyleneimine,PEI),与带负电的siRNA结合,形成(CUR@MSN)PEI/siRNA纳米共递送系统;采用透射电镜观察纳米粒制备过程;以不同浓度的纳米粒处理巨噬细胞RAW264.7,采用MTT方法检测细胞活力变化;采用FAM荧光标记的siRNA制备纳米粒后转染细胞,分别采用激光共聚焦扫描显微镜和透射电镜观察纳米粒的细胞摄取;采用靶向GAPDH的siRNA制备纳米粒后转染RAW264.7细胞,观察对靶基因的沉默效率,对照组为未处理细胞组、仅递送CUR组、CUR与siRNA阴性对照(siNC)共递送组,采用实时定量PCR检测沉默效率;进一步采用miRNA-130a-3p反义序列(antisense oligonucleotide,ASO)制备纳米粒转染巨噬细胞RAW264.7,观察对巨噬细胞极化的影响,对照组为未处理细胞组、仅递送CUR组、CUR与miRNA阴性对照(miNC)共递送组,采用Western Blot检测巨噬细胞M2极化标志物精氨酸酶1(arginase 1,Arg-1)的表达.结果 (CUR@MSN)PEI/siRNA纳米共递送系统可成功构建;纳米粒呈现剂量依赖性的细胞毒性,在10μg/mL以下浓度处理组细胞活力在90％以上;纳米粒可被细胞高效摄取,显著抑制靶基因GAPDH的表达,效率约80％(P<0.05 vs.其余各组);仅递送CUR或CUR与miNC共递送组细胞Arg-1的表达提升约3倍(P<0.05 vs.未处理细胞组),在共递送CUR和ASO后能发挥二者的协同作用,促进巨噬细胞Arg-1表达约8倍(P<0.05 vs.其余各组).结论 CUR-siRNA共递送系统可高效转染巨噬细胞实现协同诱导其M2极化的作用.

目的:重组表达和纯化靶向抗PD-1/CD19双特异性抗体(bispecific antibody, BsAb)并验证其活性.方法:以pCAR1为载体,利用分子克隆技术构建抗PD-1/CD19 BsAb真核表达载体,通过PEI试剂转染哺乳动物细胞株CHO-S瞬时表达抗体.利用亲和层析法对BsAb进行纯化,用SDS-PAGE和WB实验进行BsAb蛋白鉴定.用荧光素酶报告基因检测BsAb对PD-1/PD-L1的体外阻断活性,乳酸脱氢酶细胞毒实验检测BsAb依赖的PBMC介导细胞毒性(ADCC)活性.结果:成功构建双质粒真核表达载体pCAR 1-19X3,BsAb在CHO-S细胞中成功表达,命名为pCAR 1-19X3-TY.pCAR1-19X3-TY在体外能够有效地阻断PD-1与其配体PD-L1的结合,其量效曲线的EC50为0.306 μg/ml.ADCC结果显示,pCAR 1-19X3-TY能介导PBMC对Raji细胞产生细胞毒性,曲线呈现直线上升的趋势;当效靶比为50∶1时,pCAR1-19X3-TY的杀伤率为(38.9±0.3)％,与阳性处理组的杀伤率(46.7±4.9)％的差异比较无统计学意义(P＞0.05),明显高于阴性对照组(1.2±0.1)％杀伤率(P＜0.05).结论:重组表达的靶向抗PD-1/CD19BsAb能有效阻断PD-1和PD-L1的结合、激活PBMC介导的Raji细胞毒性作用,具有开发用于治疗B细胞恶性肿瘤的潜力.

目的 探讨超声联合生物纳米泡在体外介导基因编辑的可行性.方法 提取生物纳米泡(GVNPs),用阳离子聚合物PEI修饰其表面,再与载有向导RNA(sgRNA)的质粒共孵育构建GVNPs-PEI-DNA(GVPD)转染复合物,通过转染sgRNA进入稳定表达Cas9蛋白的细胞系的方式,介导基因编辑.实验分为空白组(Blank组)、单纯GVPD转染组(-US组)和超声联合GVPD转染组(+US组).流式细胞仪评估转染效率,CCK-8检测细胞增殖活性,流式分选结合有限稀释法筛选阳性单克隆,T7EI酶切和Sanger测序法进行鉴定.结果 超声联合GVPD组的转染效率较其他组显著增加,递送后各组细胞活力未发现显著改变,阳性单克隆的T7EI酶切和测序结果都显示出有效的基因编辑.结论 超声联合生物纳米泡可以介导基因编辑,为CRISPR/Cas9系统提供了一种新的非病毒载体递送方式.

目的 前列腺特异性膜抗原-嵌合抗原受体(PSMA-CAR)慢病毒表达载体的包装方法研究.方法 采用慢病毒三质粒病毒包装系统(Del8.9+ VSVG、PsAX2+ OG)及包装细胞(HEK-293T、HEK-293FT)在转染试剂[聚乙烯亚胺(PEI)、Lipofectamine 2000、磷酸钙]的介导下,包装慢病毒颗粒.通过检测转染效率筛选最佳包装细胞、最佳包装质粒组合、最佳转染试剂和剂量.结果 HEK-293FT细胞的转染效率高于HEK-293T细胞的转染效率.PsAX2+ OG组合的转染效率高于Del8.9+ VSVG组合的转染效率.PEI方法转染时,包装质粒相同,空载体的转染效率明显要高很多;目的 质粒相同,采用包装质粒为PsAX2+ OG组合时,转染效率更高;数据统计表明,质粒总量∶PEI的比例在1∶9时转染效率更高.Lipofectamine 2000方法转染时,包装质粒和包膜质粒相同,空载体的转染效率更高;目的 质粒和包装、包膜质粒相同,质粒总量∶Lipofectamine 2000的比例在1.0∶2.0和1.0∶2.5时转染效率显著高于其他两组比例.磷酸钙转染法时,随着加入的磷酸钙的增多,转染效率呈递减趋势.结论 采用包装质粒PsAX2和包膜质粒OG时转染效率相对更高.质粒总量和加入的PEI量比例在1∶9时转染效率更高;质粒总量和加入的Lipofectamine 2000量比例在1.0∶2.0和1.0∶2.5时转染效率更高.PEI包装法和Lipofectamine 2000包装法转染效率相当,Lipofectamine 2000包装法相对高一些,但在考虑包装成本的前提下后续大量包装PSMA-CAR慢病毒颗粒时,应选择PEI包装法.