目的 克隆青天葵黄酮类药效成分生物合成途径第一步关键酶——查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)的编码基因,并分析其序列特征及编码蛋白的功能.方法 在前期青天葵转录组测序获得的CHS基因序列片段的基础上,采用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)从青天葵叶片中获取编码CHS的cDNA全长并克隆其编码区;利用生物信息学方法对其编码蛋白进行同源性比对和功能分析.结果 克隆获得的青天葵CHS基因编码区长度为1173 bp,编码391个氨基酸.编码蛋白的氨基酸序列预测显示,青天葵CHS蛋白为酸性、亲水性蛋白,分子量约为96.9 kDa;不含有信号肽、转运肽和跨膜结构域,可能定位于细胞质中;具有CHS保守功能域,归属于CHS超家族,与文心兰等同科植物CHS蛋白的同源性可达87%.结论 成功克隆得到青天葵查尔酮合成酶基因,为后续的基因功能鉴定和生物合成调控奠定了基础.

为研究文心兰谷氧还蛋白超家族基因ROXY在花药发育中的功能,以文心兰‘南茜’(Oncidium Gower Ramsey)为试验材料,从‘南茜’的转录组网站选取一条与拟南芥AtROXY1/2相似度最高的基因序列(命名为OnROXY1),以该序列的cDNA为模版设计引物,用RT-PCR从‘南茜’花器官中扩增该基因,并对扩增产物进行测序和保守结构域分析,结果表明,OnROXY1基因编码区402 bp,编码133个氨基酸,与‘南茜’转录组网站中的预测序列只有一个碱基差异,但与该预测序列的氨基酸序列和保守结构域完全一致(GenBank登录号:MF696154).OnROXY1基因具有典型的谷氧还蛋白(Glutaredoxin,GRX)基因家族的结构域和CMCC活性位点,因此该基因属于GRX基因家族,并且属于亚类CC型的GRX基因.进化树分析表明,OnROXY1与水稻的OsROXY1、OsROXY2和拟南芥的AtROXY1、AtROXY2蛋白序列的一致性最高,进化距离最近.亚细胞定位结果显示,OnROXY1主要定位于细胞核中,少量定位在细胞质中.RT-PCR检测发现,在不同组织部位中,OnROXY1在假鳞茎中的表达量最高,唇瓣中的表达量最低;不同花期的定量结果显示,OnROXY1在脱落干枯期时的表达量最高,盛开期时的表达量最低.本研究推测谷氧还蛋白基因OnROXY1可能在文心兰假鳞茎与根的发育、消除植物体内过多的活性氧以及延缓文心兰花器官的衰老等方面具有重要作用.

为了解文心兰miRNA的序列特性及其在不同组织部位中以及软腐病侵染过程中的表达规律,该研究对文心兰转录组及miRNA数据库中的25条miRNA前体(pre-miRNA)序列和15条成熟体序列进行序列特性分析,并对25条pre-miRNAs在文心兰不同组织部位及软腐病侵染的假鳞茎中的表达情况进行实时荧光定量分析.结果显示:(1)文心兰25条pre-miRNAs序列可分为13个家族,其中包含15条成熟体序列.(2) Mfold二级结构预测显示,文心兰25条pre-miRNAs的最小折叠自由能在-32.04～-120.98 kal/mol之间,均可以形成典型、稳定的发夹结构.(3)序列比对分析发现,同一家族的前体与成熟体存在一个约20个碱基长度的保守区域,推测该区域可能为文心兰miRNA成熟体所在区域.其中,13个前体家族中,有10个家族的成熟体可以完全定位于其前体中.(4)实时荧光定量PCR结果显示,在文心兰不同组织部位中,miR159-unigene0037857、miR167-unigene0011236、miR167-unigene0002619、miR169-unigene0022341、miR172-unigene006514、miR396-unigene19032、miR398-unigene0009996、miR2950-unigene0006151、miR2950-unigene0006422等pre-miRNAs在叶片中大量累积可能有利于其叶的形态建成;miR162-unigene0003615、miR162-unigene0013441、miR166-unigene0011870、miR168-unigene0009958等pre-miRNAs同时在根和叶中均大量表达有利于其根和叶的发育;而miR171-unigene0045985、miR396-unigene0011179、miR396-unigene0011180在根和茎中的大量表达可能有利于其根和茎的发育.(5)在软腐病病菌侵染文心兰假鳞茎的过程中,miR159-unigene0037857、miR167-unigene0011236、miR396-unigene0011179、miR396-unigene0011180、miR396-unigene0019032、miR845-unigene0012489的表达总体呈下降趋势;miR162-unigene0040566、miR166-unigene0011870、miR 168-unigene0009958、miR171-unigene0045985在软腐病菌液侵染4h其表达量升高,之后表达量下调;miR162-unigene0003615、miR167-unigene0002619、miR168-unigene0047942、miR169-unigene0022341、miR845-unigene0012489在菌液侵染过程中其表达量呈现先下降后上升的趋势,并在侵染8h后表达量达到最低.研究表明,文心兰pre-miRNAs 13个家族不同成员在进化进程中具有高度保守性与特异性的结构特点,并可能广泛参与文心兰不同组织的生长发育及参与软腐病菌侵染的响应.

该研究采用PCR、RACE方法,对文心兰‘南茜’的乙烯不敏感蛋白基因(ethylene insensitive 2,EIN2)进行克隆及生物信息学分析,并采用qRT-PCR技术,对该基因在文心兰不同组织器官和不同花期中的表达模式进行分析.结果表明:(1)成功克隆得到文心兰EIN2基因序列,命名为OnEIN2(MH497388);该基因cDNA序列全长为4 177 bp,其中开放阅读框3 879 bp,编码1 292个氨基酸,3'非编码区长208 bp,5'非编码区长90 bp.(2)生物信息学分析显示OnEIN2是一个不稳定的疏水蛋白,含有跨膜结构,分子式为C6406H9988N1670O1897S47;蛋白质分子量142.22 kD,理论等电点5.80.多序列比对和系统进化分析表明,文心兰EIN2与铁皮石斛EIN2的相似度最高(81.98％),二者亲缘关系也最为接近.(3)实时荧光定量PCR分析发现,OnEIN2基因在根、茎、叶花中均有表达,在花中表达量最高,茎中表达量最低;而在不同花期中,盛开期表达量最高,其次是衰老期.研究表明,文心兰OnEIN2基因在开花和衰老过程中可能有重要的作用.

该研究以文心兰品种‘柠檬绿’(雄性不育)和‘巧克力’(可育)为试验材料,对花粉团和花粉粒的形态进行观察,并在转录组数据分析的基础上,利用 RT-PCR 技术从‘柠檬绿’中克隆了 1 个 MYB 转录因子基因(OnMYB 1 0 6 ),用 qRT-PCR技术分析该基因的相对表达量,以初步鉴定‘柠檬绿’花粉败育特征,揭示花粉败育与OnMYB 106 基因的调控关系.结果显示:(1)‘柠檬绿’花粉团药室明显变扁,外壁凹陷、皱缩.(2)‘柠檬绿’花粉细胞内含物缺失,细胞质空泡化严重,花粉粒形态异常,花粉壁发育不连续,有许多孔洞(并非萌发孔).(3 )成功克隆获得‘柠檬绿’MYB 106 的基因序列,命名为OnMYB 106,其开放阅读框为 819 bp,编码 272 个氨基酸;其基因组序列与cDNA比对显示,OnMYB 106 基因含有3 个外显子和2 个内含子.(4)生物信息学分析表明,OnMYB106 属于SANT 超家族,具有 2 个连续的 MYB DNA-binding 结构域,是一个典型的 R2R3-MYB 转录因子;进化树分析表明,OnMYB1 0 6 与高粱、水稻和二穗短柄草的 MYB1 0 6 蛋白序列的一致性最高,进化距离最近.(5)qRT-PCR分析显示,OnMYB 106 在‘柠檬绿’花粉团中下调表达;该基因在‘柠檬绿’不同组织器官中均有表达,但在花中表达量最高,假鳞茎中表达量最低;在不同花期中,花苞期表达量最高,盛开期只有微量表达.研究认为,‘柠檬绿’花粉壁发育异常可能导致其花粉败育;OnMYB 106 基因可能在‘柠檬绿’花器官的生长发育中起重要的调控作用,并且该基因可能属于花粉发育"早期"表达基因,主要影响‘柠檬绿’花粉壁的的形成.

FT(Flowering LocusT)及其同源基因被认为是植物开花、花发育相关的重要基因.为了深入研究FT同源基因的功能以及文心兰开花的分子机理,该研究以文心兰品种‘金辉’为试验材料,基于转录组测序结果,克隆获得‘金辉’FT同源基因,命名为OnFT(GenBank登录号为MK967676).OnFT基因编码区长度为537 bp,共编码178个氨基酸;生物信息学分析表明,该蛋白质分子量约为19.99 kD,可能是一种亲水性不稳定蛋白质,属于PEBP家族蛋白;基于FT的系统进化分析表明,文心兰与同科植物桃红蝴蝶兰的亲缘关系较近.qRT-PCR分析结果显示,OnFT在文心兰不同组织的表达差异较大,在花中表达量最高,在根中几乎不表达;OnFT基因在幼嫩花芽中的表达量较低,并且在花的成熟过程中逐渐增加;OnFT基因在叶片和假鳞茎中的表达量随成熟度的增长均呈先上升后降低的变化趋势,在中苗期的叶片和抽芽期的假鳞茎中表达量较高.

为揭示白及蔗糖合成酶基因与生长发育的关系,该研究以白及为材料,利用RT-PCR技术同源克隆白及蔗糖合成酶的关键基因SuSy,对SuSy基因的生物学特性及表达特征进行了分析,并利用实时荧光定量PCR检测SuSy基因在不同组织中的表达规律.结果表明:(1)白及SuSy基因长度为2 215 bp,编码737个氨基酸,与铁皮石斛、文心兰和蝴蝶兰的蛋白质氨基酸序列的相似性分别为97％、92％和95％.(2)生物信息学分析表明,SuSy蛋白质序列具有较高的亲水性,与拟南芥SuSy蛋白质氨基酸三级结构一致性为75.2％;系统进化树分析发现,白及SuSy蛋白与铁皮石斛处于同一个分支上.(3)qRT-PCR结果表明,SuSy基因在叶片中的表达量最高,块茎中的表达量最低;成熟叶片的表达量高于未成熟叶片的表达量;数据差异性分析显示,SuSy基因在根、块茎中表达量具有极显著性差异,但在一年生叶和二年生叶中的表达量无显著性差异,幼苗叶和一、二年生叶中表达量具有极显著性差异.由此推测,SuSy基因可能受生长发育的诱导,是调控白及生长发育关键基因.

CONS TANS (CO)及CONSTANS-like (COL)基因在光周期调控植物开花中起到重要的作用.该研究以文心兰(Oncidium)品种‘金辉’为材料,分离了CO同源基因OnCOL2及另外2个COL基因(OnCOL8和OnCOL9),它们分别编码326、411和291个氨基酸;生物信息分析预测它们均定位于细胞核;OnCOL2、OnCOL8有2个锌指B-box结构域和1个CCT结构域,而OnCOL9缺少B-box结构域.多序列比对及进化树分析结果表明,所有COL蛋白可划分为3组,OnCOL2与OnCOL8、OnCOL9分到了2个不同组中.OnCOL2与建兰(Cymbidium ensifolium)CeCOL(90.77％)高度相似;OnCOL8与OnCOL9在进化关系上更为接近,分别与拟南芥(Arabidopsisthaliana)AtCOL9和AtCOL10关系最近,它们在B-box和CCT结构域都极为保守.表达分析结果表明OnCOL2、OnCOL8与OnCOL9分别在花、根和假鳞茎中表达量最高,在叶片中的表达呈周期性变化趋势,且在长、短日照条件下表达的峰值及时间均存在差异,在花芽分化时期的叶片中表达量均显著上调.研究表明,OnCOL2、OnCOL8与OnCOL9基因均受到生物钟和日长调节,在光周期途径中,可能通过上调它们的表达以促进文心兰花芽的形成.该研究结果为进一步研究基因功能及光周期调控文心兰开花机制奠定了基础.

为了解铁氧还蛋白NADP+氧化还原酶(FNR)在文心兰抵御软腐病过程中的作用,该研究采用RACE技术从文心兰'小樱桃'中克隆到一条OnFNR基因(登录号为KX461908),分析其序列特性和编码蛋白亚细胞定位情况,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析其在不同组织部位以及不同软腐病感病阶段的表达模式,构建OnFNR过表达载体并转化文心兰原球茎(PLBs),对转基因原球茎进行软腐病抗性评价.结果 显示:(1)文心兰OnFNR基因开放阅读框长为1080 bp,预测可编码含359个氨基酸、分子量为40066.14 Da、等电点为8.72的碱性蛋白;OnFNR具有典型的FAD结合结构域和NADW结合结构域,定位于叶绿体.(2)多序列比对和进化树分析发现,OnFNR与其他植物LFNR聚为一类,并与小兰屿蝴蝶兰LFNR的相似度最高(89.1％).(3) qRT PCR结果显示,OnFNR在文心兰叶中的表达量最高,其次是假鳞茎与花,根中最低;文心兰植株接种软腐病病原菌1d后叶片和假鳞茎的OnFNR基因表达量呈现极显著下调,并且在5个感病阶段的表达量均低于健康植株.(4)成功构建过表达载体pCAMBIA1301-OnFNR,并经农杆菌EHA105侵染成功转入文心兰PLBs,获得过表达OnFNR转基因原球茎16个;在过表达OnFNR文心兰PLBs中,OnFNR与Fd基因表达均呈现极显著上调,尤其是Fd表达量上调至对照(非转基因PLBs)的3.67倍,且过表达OnFNR的PLBs在软腐病病原菌侵染第4天的存活率仍有48.88％,而对照的存活率只有6.66％.研究表明,文心兰OnFNR是一个定位于叶绿体的光合型铁氧还蛋白NADP+氧化还原酶,过表达OnFNR能够明显提高文心兰植株的抗病性,推测OnFNR在植物抵抗病毒以及ROS爆发中具有重要作用,且过表达OnFNR可能通过提高LET的电子传递效率,进而提高Fd的表达量达到促进MAPK通路信号传导的效果.

从文心兰侵染软腐病转录组库中鉴定出72条WRKY蛋白序列,长度分布110～719个氨基酸,平均长度319.8个氨基酸.72条文心兰WRKY蛋白序列中14条被分到I组、42条序列被分到II组、16条序列被分到III组,其中II组还可以进一步分为7个亚组;72条序列均至少含有1个WRKY结构域和C2H2型锌指基序,来自I组的序列含有2个WRKY结构域.通过对筛选的12条文心兰WRKY基因进行荧光定量分析,发现其表达基本验证高通量表达模式,并可分成三种,来自第一种与第三种的OncWRKY44(I)、OncWRKY69(IIg)与OncWRKY70(IIg)3个WRKY基因可以被外源水杨酸与茉莉酸甲酯诱导,并在共生植株的侵染位点中呈现最高表达量,它们可能是参与印度梨形孢诱导的系统抗性的重要节点基因.