对于研究转基因农作物来说,建立其检测方法至关重要.本研究利用TAIL-PCR法,获得了转基因水稻U41的右旁侧序列,结果显示T-DNA插入位点在水稻1号染色体第22 013～22 014之间.通过设计引物扩增左旁侧序列,建立了U41转化事件特异性检测的方法,可以从含0.1％目的基因中扩增出529 bp的特异性条带;还建立了三引物检测的方法,能快速和准确地鉴定U41的纯合株系.这些方法的建立,缩短了获得U41纯合体的时间,对U41的检测、研究和利用具有实用价值.

利用hiTAIL-PCR(high efficient thermal asymmetric interlaced PCR)法扩增获得了转基因水稻BPL9K-2的外源基因插入位点的左旁侧序列450bp,与水稻参考基因组数据比对发现其左边界插入在水稻基因组第10号染色体短臂的1 037 765位核苷酸残基之后.根据水稻参考基因组序列和外源基因右边界序列,设计引物扩增得到485bp的特异片段,通过数据库比对发现其右边界插入在水稻基因组第10号染色体短臂的1 037 825位核苷酸残基之前.因为外源基因插入和非正常重组,水稻基因组上缺失了59个核苷酸.基于左右旁侧序列,建立了转基因水稻BPL9K-2的事件特异性定性PCR检测方法,可以分别扩增到片段大小为449bp和485bp的特异条带.该方法特异性好,灵敏度高,能够在BPL9K-2基因组DNA相对含量为0.1％的模板中检测出转基因成分.依据旁侧序列,建立了快速鉴定转基因后代植株外源基因型的三引物PCR检测方法.这些方法的建立,为转基因水稻BPL9K-2的应用和检测提供了技术支持.

玉米是我国第一大作物,在保障我国粮食安全中发挥重要作用.通过转基因技术培育具有抗病虫等性状的转基因玉米新品种,可有效减少产量损失.培育的转基因玉米需要鉴定外源基因整合位点,为转基因玉米的安全性评价提供重要依据.以一个抗虫转基因玉米事件IE34为材料,采用热不对称PCR(TAIL-PCR)和遗传定位方法,鉴定外源基因整合位点及旁侧序列.通过TAIL-PCR得到一段长度为776 bp的玉米基因组序列.分别在旁侧序列和外源基因上游序列设计特异性引物,建立了转基因玉米事件特异性的PCR鉴定方法.将旁侧序列在MaizeGDB中进行比对分析,发现此序列是重复序列而且存在于多条染色体上.构建转基因玉米IE34与自交系B73的F2代遗传分离群体,通过BSR-Seq方法确定外源基因整合在玉米第5染色体短臂2.32-2.70Mb区间内.通过精细定位将外源基因整合位点缩小在第5染色体2.35-2.61 Mb约260 kb的区间内.本研究结果表明,对于整合位点旁侧序列复杂的转基因事件,TAIL-PCR结合遗传定位方法能够有效鉴定外源基因的整合位点.

利用染色体步移方法分离获得转cry1C基因抗虫水稻吉生粳3号外源基因旁侧序列及其水稻基因组中的插入位点,并建立了吉生粳3号品系特异性PCR检测方法.通过对吉生粳3号外源基因左、右边界旁侧序列分别与水稻基因组序列和T-DNA序列的比对分析确定其插入位点,发现T-DNA在水稻基因组(日本晴)2号染色体上的基因间区2790685-2790589位点(GenBank登记号:NC_029257.1).根据T-DNA插入位点,在插入位点两侧基因组区域和T-DNA左边界设计特异性引物,建立了吉生粳3号事件特异性PCR检测方法,为吉生粳3号的身份识别提供了准确、快速的检测技术手段.

目的 探讨基于T2对比剂增强背景抑制三维可变翻转角快速自选回波序列(3D-SPACE)的增强扫描技术在诊断旁侧型腰椎间盘突出中的应用价值.方法 回顾性分析34例旁侧型腰椎间盘突出患者的影像学和临床资料,按突出髓核组织与受累神经根的位置关系分为肩型、腋型和根型,分析磁共振神经成像(MRN)所示不同水平各型椎间盘突出卡压神经根的情况.结果 34例患者共获得36组数据,病变主要集中在L3～S1椎间盘水平.3D-SPACE增强扫描示肩型、腋型及根型突出分别为10处、11处和15处,36.1％的突出累及相应神经根,63.9％的突出累及下一椎体神经根.以临床手术和体征为金标准,MRN的敏感性为97.3％,特异性为100％,阳性预测率为100％,阴性预测率为83％;常规扫描敏感性为86.5％,特异性为20％,阳性预测率为89％,阴性预测率为17％.结论 与常规扫描比较,MRN与临床结果一致性较高,且可对腰椎间盘突出卡压的神经根进行具体且全面的评估,对患者的治疗方案选择、术前评估、手术方案制定等具有重要的指导意义.

目的 分析去糖基化及片段长度对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)受体结合结构域(RBD)三聚体蛋白免疫原性的影响.方法 以SARS-CoV-2 S蛋白的RBD为基础,分别突变敲除长度为220个氨基酸的RBD(aa.331-550)中的3个N-糖基化残基(N331、N343、N360),并分别在C端融合三聚化结构域,利用杆状病毒-昆虫细胞表达3个去糖基化的三聚体蛋白(RBDT-N1、RBDT-N2、RBDT-N3);同时构建表达2种糖基化位点不变的三聚体蛋白,即去糖基化蛋白的野生型对照RBDT和长度为273个氨基酸的RBDST(aa.319-591).Western blot比较蛋白表达水平,亲和层析纯化后免疫小鼠,分析血清中RBD特异性IgG及SARS-CoV-2假病毒中和抗体水平.结果 RBDT-N1、RBDT-N2及RBDT-N3的表达水平均较RBDT显著提高,3种去糖基化蛋白诱发的特异性IgG及假病毒中和抗体水平均与RBDT的相当;RBDST诱发的特异性IgG抗体及假病毒中和抗体滴度较RBDT的显著提高(P<0.05,P<0.01).结论 去除RBD的N-糖基化残基及适当延长RBD旁侧序列有利于提高RBD蛋白疫苗的表达水平及免疫原性,研究结果为以RBD为基础的SARS-CoV-2疫苗的研发策略提供了参考.

用腮腺炎病毒小疏水蛋白（SH）基因及其旁侧区的逆转录（RT）套式聚合酶链反应（N-PCR）产物进行银染单链构象多态性（SSCP）分析，建立了较适的样品变性和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）条件。根据单链电泳模式可将所测6株腮腺炎病毒分为四种SSCP模式，3株兰州野毒株Wlz1，Wlz2，Wlz3呈现一种模式，这3株病毒的SH基因及其旁侧区cDNA序列之间平均差异仅为0.96%；两株上海野毒株Wshl和Wsh2株的相应序列之间差异为4%，呈现另两种模式。Enders株呈现一种与野毒株差别较大的特殊模式。3株兰州野毒与2株上海野毒相应区域序列之间差异为3.4%～4.5%，故本法可区别SH基因及其旁侧区cDNA序列之间差异为3.4%的野毒株，且SSCP模式的相近程度与相应区域中核苷酸序列同源性大小一致。此法可用于腮腺炎病毒株分子特性和遣传变异的初步鉴定和分子流行病学研究。

目的:利用全外显子测序技术,筛选无精子症患者相关基因,丰富男性不育基因库.方法:抽取20例无精子症患者外周血,提取DNA,使用杂交捕获方法构建DNA文库,采用高通量测序技术检测人类全外显子组中20099个基因的外显子区及旁侧内含子区(20bp),将测序数据与人类基因组hg19参考序列进行比对,筛选变异基因,变异位点进行Sanger测序验证.结果:共计筛选出26个基因43个变异位点,排除15个常染色体隐性遗传的单个变异位点及13个与精子运动相关的变异位点,剩余11个基因的15个变异位点可能与精子发生障碍相关,其中包括FAM71B、STARD9、CLTCL1、PCBP3、S100PBP等5个在睾丸组织高表达基因,SYCE3、EFCAB6、DDX4、KDM5D、RGS22、MTL5等6个基因可能与精子发生障碍相关.结论:通过研究筛选到可能影响男性不育的基因,为男性不育的基因诊断研究提供参考.

目的 对一个单纯型甲基丙二酸血症(MMA)家系进行基因突变的检测和分析,探讨其发病的分子遗传学病因.方法 分别用串联质谱技术、气象色谱-质谱技术对先证者血丙酰基肉碱、丙酰肉碱/乙酰肉碱比值,尿液甲基丙二酸、甲基枸缘酸进行检测;全外显子及其旁侧序列测序,Sanger测序法进行基因突变检测.用生物信息学软件Polyphen-2、SIFT预测突变位点危害程度;采用Clustal X软件分析突变位点的物种保守性;运用Swiss-Pdb Viewer软件对突变基因进行蛋白模型和氨基酸相互作用分析.结果 先证者利用气相色谱/质谱串联技术检测多项指标异常增高;MUT基因检测到两个杂合突变,分别为c.1280G>A(p.Gly427Asp)和c.1677-1G>A(p.?),家系分析示前者遗传于母亲,后者遗传于父亲.c.1280G>A(p.Gly427Asp)位点Polyph-en-2和SIFT软件预测该突变为有害突变.Clustal X软件分析显示p.Gly427Asp在同源物种间高度保守.突变蛋白模型分析显示p.Gly427Asp通过改变MCM连接区空间构象,致使MCM自身缺陷.c.1677-1G>A(p.?)为固有剪切突变,可破坏固有剪切位点致使外显子完全不识别.结论 该家系先证者为遗传性单纯型MMA,位于MUT基因的两个突变位点c.1280G>A(p.Gly427Asp)和c.1677-1G>A(p.?)是导致单纯型甲基丙二酸血症的主要原因.MMA MUT基因型的分子诊断将有助于对不同类型MMA患者提供精准治疗导向,同时有助于进行家系携带者检测和产前诊断分析.

用多囊肾病基因PKD 1的旁侧序列探针24-1与TaqI酶解后69名正常人的DNA杂交，发现了24-1在中国四川地区人群中有B 1和B 2两种等位基因。前者为3.8kb的一个片段，后者为1.5kb和1.3kb的两个片段。B 1、B 2的基因频率分别为0.760和0.240，24-1的多态信息量为0.365。与国外资料比较表明，24-1的等位基因似具有民族或地区特点。联合采用分别位于PKD 1两侧的探针3'HVR和24-1对3个成年型多囊肾病家系进行了基因连锁分析，结果表明：3个家系中有2个家系既与3'HVR连锁，也与24-1连锁，肯定了这两个家系中多囊肾病是由于PKD 1基因异常引起，并对有关的风险成员作了发病前早期诊断。由于使用了双侧探针，对非重组的个体诊断的准确性超过99%。第3个家系与24-1杂交无信息。并对24-1在连锁诊断中的意义和局限性进行了讨论。