[目的]海藻糖酶(trehalase,Tre) 作为昆虫体内海藻糖代谢的关键性酶,在昆虫能量调节和生长发育中具有重要作用.本研究旨在克隆获得沙葱萤叶甲Galeruca daurica 海藻糖酶基因,并对其表达模式进行定量分析,以期探究海藻糖酶在沙葱萤叶甲生长发育和成虫夏滞育中的作用.[方法]根据沙葱萤叶甲转录组数据,采用RACE 技术,克隆得到Tre 基因的cDNA 全长,并进行生物信息学分析; 应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR) 技术检测其在沙葱萤叶甲不同发育阶段[卵、 1 - 3龄幼虫、预蛹、蛹、成虫(羽化后3,7,10,15,25,40,60,80 和100 d) ]、成虫不同组织(头、胸和腹) 以及3 日龄成虫在不同温度(15,20,25,30,35 和40℃) 胁迫下的表达水平; 采用3,5-二硝基水杨酸法测定不同日龄成虫体内海藻糖酶活性.[结果]克隆获得了沙葱萤叶甲可溶性海藻糖酶基因,并命名为GdTre1(GenBank 登录号: KY697913),该基因全长1 933 bp,开放阅读框1 704 bp,编码567 个氨基酸; 蛋白预测分子量为66. 56 kD,等电点为6. 62; 编码蛋白具有海藻糖酶超基因家族典型的功能结构域,包含1 条信号肽,不具有跨膜结构.同源序列比对和系统发育分析表明,GdTre1 与马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata Tre1b 的同源性最高,氨基酸序列一致性达 70. 25％.RT-qPCR 检测结果表明,GdTre1 在沙葱萤叶甲各发育阶段均有表达,其中在卵期和成虫滞育期间高表达,而在幼虫、预蛹、蛹及成虫滞育前低表达; 在成虫不同组织中,通常在腹部中表达量最高,其次为胸部,最低为头部; GdTre1 表达量随着温度升高而上升,30℃达最高值,而后随温度升高略有下降.沙葱萤叶甲不同日龄成虫体内GdTre1 表达量及Tre 活性存在显著差异,且GdTre1表达量与Tre 活性变化趋势一致.[结论]海藻糖酶与沙葱萤叶甲生长发育和成虫夏滞育有密切的关系.该结果为进一步揭示该虫的夏滞育分子机理提供了必要的基础.

海藻糖广泛存在于细菌、真菌、动物和植物中.它不仅作为能量储备物质,在外界环境胁迫或内部代谢紊乱时,也可作为保护因子,保护其生命体度过逆境.昆虫海藻糖合成酶与海藻糖酶分别是海藻糖合成与分解的关键酶,合成的海藻糖在海藻糖转运蛋白的帮助下由胞内进入胞外.胰岛素与脂动激素直接参与昆虫糖代谢,保幼激素与蜕皮激素通过和胰岛素与脂动激素通路偶联,间接参与调控昆虫海藻糖代谢.海藻糖代谢途径和昆虫生长发育密切相关,昆虫海藻糖代谢信号通路为开发害虫控制的新靶标提供理论依据.

[目的]克隆和鉴定葱蝇Delia antiqua叉头转录因子1基因,探究其在葱蝇夏滞育前期蛹体内糖代谢和脂代谢中的作用.[方法]本研究基于葱蝇转录组数据利用3'RACE法克隆叉头转录因子1基因的全长开放阅读框;利用生物信息学法分析了该基因编码蛋白的序列特征、保守结构域和二级结构,并采用最大似然法对其与其他13种昆虫来源的同源序列进行了聚类分析.通过RNA干扰技术沉默目的基因后,采用实时定量PCR法分析葱蝇夏滞育前期蛹体内目的基因下游脂肪酶brummer基因(DaBmm)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(DaDepck)的表达规律,并对甘油三脂(TAG)、海藻糖和葡萄糖含量及总脂肪酶的活性变化进行分析.[结果]克隆得到了葱蝇叉头转录因子1基因DaFOXO1(GenBank登录号:MG813258),其编码蛋白含有619个氨基酸,具有典型的叉头DNA结合域,核定位信号,2个14-3-3结合区和1个富含谷氨酰胺区;DaFOXO1与铜绿蝇Lucilia cuprina FOXO1蛋白的氨基酸序列有87％的一致性,并与其聚为一支.干扰葱蝇夏滞育前期蛹DaFOXO1后,8-20 h间可显著抑制DaBmm基因的表达,12-24 h间可显著影响TAG含量和总脂肪酶的活性,8-20 h(16 h除外)间可显著降低DaPepck的表达,但对葡萄糖和海藻糖的含量没有显著影响.[结论]本研究结果表明海藻糖和葡萄糖的积累在化蛹前已完成;DaFOXO1对DaBmm和DaDepck基因的表达调控可能有利于葱蝇夏滞育前期蛹体内的脂肪积累.同时也表明靶向Bmm依赖性脂类水解过程及其下游因子可为打破昆虫滞育提供一种有效策略.

在昆虫中已发现成熟的典型胰岛素信号通路,但是其调控海藻糖代谢途径的机制还未清晰.为探讨胰岛素受体基因在褐飞虱海藻糖代谢平衡及其发育的调控作用,本文采用RNAi技术抑制胰岛素受体(InR)基因的表达,测定处理后海藻糖、糖原和葡萄糖含量及海藻糖酶活变化,并检测InR、类胰岛素多肽(Ilp)、海藻糖代谢途径中关键基因的表达.研究结果表明dsRNA注射后能够显著抑制Ilp和InR基因的表达;InR1低表达后72 h能够显著抑制3种糖类物质的含量;InR表达抑制后72 h可溶性海藻糖酶活性上升,而膜结合型海藻糖酶活性下降;当InR表达受抑制后3个海藻糖酶和2个海藻糖合成酶基因的表达都显著下降.这些结果说明InR能够影响海藻糖等糖类物质的平衡.从而为将来通过调控昆虫血糖平衡来控制害虫提供理论依据.

[目的]异色瓢虫Harmonia axyridis是一种重要的捕食性天敌昆虫,海藻糖在异色瓢虫的变态发育、羽化等整个生命过程都起着重要的作用.本研究以前期获得的类似膜结合型海藻糖酶(TRE2-like)与膜结合型海藻糖酶(TRE2)基因为基础,探讨在异色瓢虫羽化阶段这两个海藻糖酶的潜在功能,为阐明异色瓢虫从蛹发育到成虫时海藻糖代谢机制提供参考.[方法]根据TRE2-like和TRE2基因序列设计双链RNA(dsRNA)区域片段并合成对应的dsRNA,通过RNAi将其注射到异色瓢虫2日龄蛹中.采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测RNAi处理后羽化第1天的异色瓢虫成虫糖代谢相关基因的表达;同时采用蒽酮比色法、酶标法等分别测定RNAi处理后羽化第1天的异色瓢虫成虫主要糖类物质含量及TRE活性变化,并观察异色瓢虫羽化后的表型变化.[结果]结果表明,与对照组(dsGFP注射组)相比,异色瓢虫2日龄蛹被注射TRE2-like或TRE2 dsRNA后,其新羽化成虫体内TRE2-like和TRE2表达量均极显著下调,且少数个体出现了蜕皮与翅形成困难等畸形表型.可溶性海藻糖酶活性在注射dsTRE2-like后显著降低,膜结合型海藻糖酶活性在注射dsTRE2后显著降低;注射dsTRE2后糖原含量显著下降,注射ds TRE2-like后糖原和海藻糖含量显著下降,注射dsTRE2-like+ dsTRE2后糖原和葡萄糖含量显著下降,且海藻糖含量极显著下降.注射dsTRE2-like,dsTRE2和dsTRE2-like+ dsTRE2后可溶性海藻糖酶基因TRE1-1和TRE1-2表达下降或显著下降,而TRE1-5表达上升或显著上升,海藻糖合成酶(trealose-6-phosphate synthase,TPS)、糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase,GP)、糖原合成酶(glycogen synthase,GS)基因的表达均显著下调.[结论]TRE2-like和TRE2基因表达被抑制后,异色瓢虫海藻糖等代谢受到影响.研究结果为探究异色瓢虫体内膜结合型海藻糖酶的潜在功能和调控机制奠定了基础.

为明确球孢白僵菌毒素对宿主昆虫糖代谢水平的作用,本研究检测了家蚕幼虫感染球孢白僵菌和注射球孢白僵菌毒素之后组织中海藻糖和糖原含量的变化,以及糖代谢相关基因表达水平的变化;分析了注射毒素和添食海藻糖之后对家蚕幼虫存活率的影响、以及添加毒素之后对BmN细胞的损伤作用.结果 表明,家蚕幼虫感染球孢白僵菌和注射毒素后海藻糖和糖原含量显著降低;BombyxinA2和BmIBP2基因显著上调表达,而糖代谢酶系基因则显著下调表达.注射毒素显著降低家蚕5龄幼虫的存活时间,而补充海藻糖能够延长家蚕幼虫的存活时间.添加毒素能够使家蚕BmN细胞发生凝集作用而最终崩解死亡,并诱导BombyxinA2和BmIBP2基因显著上调表达以及糖代谢酶系基因显著下调表达.以上结果说明,球孢白僵菌可能通过分泌毒素,作用于家蚕类胰岛素信号通路,调节家蚕自身糖类物质的代谢与合成,破坏家蚕能量代谢与储存平衡,引起家蚕组织细胞凋亡并最终导致家蚕死亡.本研究结果对农林害虫的生物防治、家蚕等经济昆虫僵病防治技术的研究以及球孢白僵菌毒素用于新型降糖药物的筛选和中药僵蚕的开发利用均具有重要意义.

[目的]昆虫中海藻糖主要通过海藻糖合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)在脂肪体中合成,当昆虫受极端环境胁迫时TPS能够诱导海藻糖累积从而起到保护作用.本研究旨在分析白背飞虱Sogatella furcifera两个TPS基因的发育和组织表达模式及其对糖类物质代谢调控功能,探究TPS基因在白背飞虱生长发育中的具体作用.[方法]基于实验室前期获得的两个海藻糖合成酶基因SfTPS1和SfTPS2片段序列,在本实验中也进行了基因克隆和测序筛选,比对两者确定了白背飞虱两个TPS基因序列.并通过MEGA 7.0软件构建基于氨基酸序列的白背飞虱与其他昆虫TPS的系统发育树.利用qRT-PCR技术检测这两个基因在白背飞虱不同发育阶段(4龄第1天若虫至3日龄成虫)和成虫不同组织(头、足、翅、中肠、脂肪体、表皮和马氏管)中的表达情况.合成这两个基因的dsRNA,并注射到白背飞虱5龄第1天若虫中进行RNAi.在RNAi 48和72 h后检测白背飞虱海藻糖酶基因TRE1-1,TRE1-2和TRE2的表达变化,海藻糖、葡萄糖和总糖原含量以及海藻糖酶活性.[结果]克隆获得白背飞虱SfTPS1和SfTPS2,ORF分别为2 424和2 115 bp,编码氨基酸数目分别为807个和704个,预测蛋白质分子量分别为90.37和80.56 kD,等电点分别为6.08和6.10.而且白背飞虱2个TPS氨基酸序列与褐飞虱Nilaparvata lugens TPS1和TPS2的一致性最高.发育阶段表达模式表明,白背飞虱TPS基因SfTPS1和SfTPS2在4龄若虫到成虫阶段都有表达;组织表达模式表明,SfTPS1和SfTPS2在成虫马氏管、中肠和表皮中的表达较为显著.当SfTPS1被RNAi后,TRE1-1和TRE2的表达水平与对照组(dsGFP注射组)相比分别为略有上升和显著升高,TRE 1-2的相对表达水平在SfTPS1被RNAi 48 h后显著上升而在72 h后显著下降;可溶性海藻糖酶活性无显著变化,膜结合型海藻糖酶活性显著增加;白背飞虱5龄若虫体内海藻糖、葡萄糖和总糖原含量显著上升.TRE1-2和TRE2基因的表达水平在SPS2被RNAi 48 h后显著升高,而在72 h后两基因的表达水平却显著下降;TRE1-1基因的表达水平在注射dsSfTPS2 48和72 h后均显著上升.可溶性海藻糖酶活性在SfTPS2被RNAi 48 h后显著下降,72 h后显著上升;膜结合型海藻糖酶活性在SfTPS2被RNAi 72 h后显著增加.白背飞虱5龄若虫体内葡萄糖含量在SfTPS2基因RNAi 48 h后显著减少,但在72 h后海藻糖、葡萄糖和总糖原含量显著上升.[结论]通过调节白背飞虱体内TPS基因的表达影响TRE1-1,TRE 1-2及TRE2基因的表达水平,进而调控体内海藻糖的含量,该结果为后期采用TPS为靶标基因用于害虫防治提供理论依据.

[目的]玉树蝠蛾Hepialus yushuensis是青海省冬虫夏草主产区优势寄主昆虫,主要分布在海拔3000-5000 m的高寒草甸,该区域年平均温度不足5 ℃.通过对玉树蝠蛾幼虫体内糖类物质含量和关键酶活性的分析,探讨冬虫夏草寄主蝠蛾的高寒适应性机制.[方法]以玉树蝠蛾幼虫4龄幼虫为研究对象,分析蝠蛾幼虫在温度为5、15和25 ℃的条件下,分别处理1、2和4h后体内的糖原、果糖、海藻糖和山梨醇4种糖类物质含量的变化,以及海藻糖酶、3-磷酸甘油脱氢酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶活性的变化.[结果]低温(5℃)条件下玉树蝠蛾幼虫体内糖原含量显著低于对照处理(15 ℃)(P＜0.05),高温(25 ℃)条件下玉树蝠蛾幼虫体内糖原含量显著高于对照处理(15℃)(P＜0.05).玉树蝠蛾幼虫体内海藻糖、果糖和山梨醇含量在低温(5℃)条件下均呈现一定的增加趋势,而在高温(25 ℃)条件下均呈一定的下降趋势.低温(5 ℃)条件下海藻糖酶活性显著低于对照处理(15 ℃)(P＜0.05),而在高温条件下(25 ℃),海藻糖酶活性显著高于对照处理(15 ℃)(P＜0.05).5 ℃处理一定时间后玉树蝠蛾幼虫体内3-磷酸甘油脱氢酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶活性均显著高于对照处理(15 ℃)(P＜0.05),这表明玉树蝠蛾幼虫通过调控体内有氧代谢和糖酵解代谢水平,加快糖原等糖类物质转化为小分子抗寒物质以提高虫体的抗寒能力.[结论]玉树蝠蛾幼虫体内糖原的分解与3种单糖和糖醇含量的增加密切相关,与糖类物质代谢相关的3种关键酶活性的变化趋势同4种糖类物质的变化趋势相吻合,玉树蝠蛾幼虫体内糖代谢过程受到海藻糖酶、3-磷酸甘油脱氢酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶的调控.

海藻糖转运蛋白(Trehalose transporter,Tret)可将昆虫"血糖"——海藻糖由脂肪体转运到血淋巴中,是维持昆虫体内海藻糖平衡的重要转运蛋白.本研究通过对褐飞虱Nilaparvata lugens两条糖转运蛋白序列(NlTret1、NlTret1 X1)进行生物信息学分析,并利用RNAi技术沉默NlTret1与NlTret1 X1基因,探讨其对褐飞虱调控海藻糖代谢的生物学功能.生物信息学分析表明,NlTret1与NlTret1 X1分别有1 353 bp和1 488 bp的开放阅读框,编码具有450和495个氨基酸残基,蛋白分子量大小为49.984 kDa和53.059 kDa,理论等电点pI为6.53和7.46;保守结构域分析NlTret1和NlTret1 X1分别包含10个和12个跨膜结构域,属于MFS超家族;二级结构以及三级结构预测NlTret1和NlTret1 X1主要包含无规卷曲和a螺旋结构.进化树分析显示NlTret1和NlTret1 X1皆与同为半翅目昆虫的Tret1蛋白亲缘关系接近.与注射dsGFP相比RNAi后显著抑制了靶标基因的表达量.荧光定量检测海藻糖代谢通路TRE和TPS基因,结果显示注射dsNlTret1 48 h后NlTRE1-1、NlTPS2基因表达量极显著下调,NlTRE1-2、NlTRE2与NlTPS1、NlTPS3基因表达量极显著上调;而注射dsNlTret1 X1则为NlTRE1-1、NlTRE2与NlTPS1、NlTPS2基因表达量极显著降低,NlTRE1-2和NlTPS3基因表达量极显著增高.注射dsNlTret1与dsNlTret1 X1后海藻糖酶活性均显著性降低,同时NlTret1的沉默显著抑制了糖原含量和海藻糖含量,NlTret1 X1的沉默仅使葡萄糖含量显著增高.褐飞虱两条糖转运蛋白序列经初步分析确定为海藻糖转运蛋白,这两个海藻糖转运蛋白在转运糖类物质中发挥着不同的作用,其中NlTret1 X1可能参与葡萄糖运输功能,而NlTret1则更可能参与海藻糖特异性转运.研究结果有利于探究海藻糖转运蛋白Tret调控海藻糖代谢的作用机制,为将来通过其调控昆虫海藻糖代谢平衡治理褐飞虱等害虫提供理论依据.

几丁质在昆虫的生长发育中具有重要作用,与蛋白质相互作用形成角质层,保护昆虫免受外界伤害,并参与昆虫生长发育过程中周期性蜕皮等重要生理活动.几丁质的合成由糖代谢、海藻糖合成和几丁质合成等多个途径协调完成,包括海藻糖酶(TRE)和几丁质合成酶(CHS)在内的8种酶参与协同催化.RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是用于研究几丁质合成途径中关键酶类基因功能的重要方法之一.本文概述了昆虫几丁质生物合成途径中关键酶的基因组成,及RNAi处理后不同酶类基因的表达与昆虫表型之间的关系,为全面认识几丁质合成途径关键酶的功能、作用机理以及开发新型杀虫剂防治害虫奠定基础.