环孢霉素A是一种主要由膨大弯颈霉Tolypocladium inflatum产生的环肽类次级代谢产物,临床上被广泛用作免疫抑制剂,其合成需要特殊底物(4R)-4-[(E)-2-butenyl]-4-methyl-L-threonine(Bmt),但目前相关Bmt的研究很少.基因敲除实验证实Bmt的生物合成需要一个聚酮合酶(polyketosynthase,PKS)基因(simG)参与,并推测其功能为合成 Bmt 的前体化合物羧酸分子 3(R)-hydroxyl-4(R)-methyl-6(E)-octenoic acid(B1).本研究通过在同为虫生真菌的球孢白僵菌 Beauveria bassiana中异源表达simG,以证明该基因的功能.通过克隆获得了较大基因 simG,利用根癌农杆菌 Agrobacterium tumefaciens介导方法将该基因转化到球孢白僵菌中,通过基因检测和半定量RT-PCR筛选出目标基因表达量高的菌株,获得 4株simG高表达菌株.将其发酵培养后,利用LC-MS检测发酵产物,发现在simG高表达菌株中存在与B1分子量相同的产物峰.本研究进一步证明了simG负责化合物B1的合成,是Bmt合成的关键基因.本研究进一步加深了对环孢霉素的生物合成机理的认识,为构建Bmt高产的工程菌株提供理论支撑,有望从解决底物来源角度促进环孢霉素生产效率的提高.

本研究将球孢白僵菌Beauveria bassiana和摩西球囊霉菌Glomus mosseae作为混合菌剂接种于烟草.设置了未施菌(CK)、单施球孢白僵菌(BB)、单施摩西球囊霉菌(GM)和混合施菌(MIX)4 个不同处理,并对田间烟草整个生长周期的农艺性状、叶绿素 SPAD 值、干物质积累和石油醚提取物(PEE)含量进行了测定.结果表明:混合施菌处理能显著提高苗期根系的农艺性状,表现出对根系的促生作用;幼苗的干物质积累也得到显著提升.移栽后,混合施菌处理的植株的最大叶面积、叶片数、茎围和株高相较于未施菌组均得到显著提升,植株叶绿素含量得到显著增加,干物质积累量提高了 1.24-1.32倍.在移栽 60 d后,MIX植株叶绿素含量显著降低,降幅达 20.1%.混合施菌处理显著提高了上部成熟烟叶的PEE含量,其中在B2F和B3F等级烟叶中分别提高了 5.70%和 6.68%.球孢白僵菌和摩西球囊霉的混合应用在烟草不同生长阶段均具有协同增效作用,显著改善了烟草的根系发育,提高了植株的生长势和上部叶PEE的含量.

本研究旨在通过蛋白质工程手段获得结构均一性更好、活性更高、抗真菌能力更强的家蚕蛋白酶抑制剂BmSPI38 的串联多聚体蛋白.利用原核表达技术获得BmSPI38 串联多聚体蛋白,并通过蛋白酶抑制剂胶内活性染色、蛋白酶抑制实验和真菌生长抑制实验等探讨串联多聚体化对BmSPI38的结构均一性、抑制活性和抗真菌能力的影响.活性染色结果表明,基于多肽柔性接头的串联表达能够极大提高 BmSPI38 蛋白的结构均一性.蛋白酶抑制实验表明,基于接头的串联三聚体化和四聚体化能提高 BmSPI38 对微生物蛋白酶的抑制能力.孢子萌发实验表明,His6-SPI38L-tetramer 对球孢白僵菌(Beauveria bassiana)分生孢子萌发的抑制能力显著强于His6-SPI38-monomer.真菌生长抑制实验显示,能够通过串联多聚体化来增强BmSPI38 对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和白色念珠菌(Candida albicans)的抑制能力.本研究成功实现 BmSPI38的串联多聚体在大肠杆菌中的异源活性表达,并证实可通过串联多聚体化来增强 BmSPI38 的结构均一性和抗真菌能力,不仅可为培育抗真菌转基因家蚕提供重要的理论依据和新策略,还将推动BmSPI38 的外源生产及在医疗领域的应用.

[目的]基于自然微栖境中两种寄生性天敌球孢白僵菌Beauveria bassiana-管氏肿腿蜂Sclerodermus guani之间存在竞争和寄生的复杂关系,探究球孢白僵菌胁迫下寄生蜂的适应性生殖策略,并综合评价寄生蜂亲代携带球孢白僵菌(简称"携菌")后对自身及其子代的致死和寄生效应.[方法]采用浸虫法用不同浓度(1 ×104,1 ×105和1 ×106孢子/mL)球孢白僵菌孢悬液(简称"菌液")处理亲代(F48代)管氏肿腿蜂雌成蜂后接入装有寄主松墨天牛Monochamus alternatus幼虫的试管中,测定亲代(F48代)雌成蜂及其子代(F49代)雌成蜂的死亡率、累计死亡率和校正死亡率、产卵前期、产卵期、总产卵量及单雌产卵量;子代(F49代)和子二代(F50代)的平均发育历期、存活率、单雌体重及性比(雄性占比),结合时间-剂量-死亡率模型(time-dose-mortality model,TDM)测定球孢白僵菌对F48和F49代雌成蜂致死过程中的剂量效应和时间效应.[结果]亲代(F48代)雌成蜂携菌量随菌液浓度升高而增加,1× 104,1 × 105和1 × 106孢子/mL浓度下平均初始携菌量为0.91 ×104,1.73 ×104和1.95 ×104孢子/雌,且能将病原菌传递给下一代(F49代),1 ×104,1 × 105和1 ×106孢子/mL浓度下平均携菌量为0.78 × 104,1.40 × 104和1.51 × 104孢子/雌;该携菌现象还影响着F48和F49代雌成蜂的寿命与繁殖及其对应子代F49和 F50代的适合度.与对照(未接种球孢白僵菌)相比,不同浓度球孢白僵菌孢悬液胁迫时,亲代(F48代)雌成蜂及子代(F49代)雌成蜂的表现发生了一系列显著变化,包括:平均产卵前期明显缩短(F48代缩短了 1.03,1.43和2.03 d;F49代缩短了 0.30,0.80和1.00 d),平均产卵期延长(F48代延长了 0.30,1.00和1.30 d;F49代延长了0.43,0.73和1.43 d),总产卵量增加(F48代增加了 4.80,17.16和10.33粒;F49代增加了 11.57,25.04和9.14粒),但单雌产卵量减少(F48代减少了 4.07,7.06和15.98粒;F49代减少了 5.30,9.37和20.47粒);同样,相应后代(F49和 F50代)适合度也呈同样变化趋势;因亲代(F48代)雌成蜂携带的不同浓度球孢白僵菌(1 ×104,1 ×105和1 ×106孢子/mL)传代,F49和F50代的幼虫发育进程加快,与F49代相比,F50代的代时分别缩短了 3.00,3.00和4.00 d;同时F50代的存活率及羽化率分别降低了 16.21％和19.40％,但单雌体重分别增加了 0.09和0.94 mg,雄性后代比例分别下降了1.95％和0.22％.TDM模型检测表明,亲代(F48代)雌成蜂在接种高浓度(1 × 106孢子/mL)菌液20 d时死亡率达到50.83％,其相应子代蜂(F49代)在羽化后第18天死亡率达到50.00％,此时球孢白僵菌对F48代雌成蜂的LT50值为22.72 d,对F49代雌成蜂的LT50值为24.52 d;而同期1 × 104和1 ×105孢子/mL浓度处理下,F48和F49代雌成蜂死亡率均低于40.00％.[结论]管氏肿腿蜂亲代雌成蜂携菌后不仅降低了自身繁殖力还会间接影响其子代的存活和发育;亲代雌成蜂的携菌浓度直接影响着自身及其子代雌成蜂的累计死亡率,且随菌液浓度升高、时间延长而增加;球孢白僵菌对管氏肿腿蜂雌成蜂致死过程中的剂量效应和时间效应存在显著的互作关系.

[目的]昆虫肠道共生细菌是栖息在昆虫肠道中的微生物,是肠道微生物群落中最主要的成员.它们对昆虫的生长发育、营养吸收以及免疫系统均具有重要影响.本研究通过对小菜蛾Plutella xylostella肠道共生细菌进行分离培养和功能鉴定,以探究肠道共生细菌对小菜蛾适应性的影响及其对真菌的广谱抑制作用.[方法]利用体外平板培养分离纯化小菜蛾3龄幼虫肠道细菌PxG45菌株,结合形态学、16S rDNA基因测序和生理生化测定进行菌种鉴定.利用生物测定探究PxG45对小菜蛾3龄幼虫存活率及球孢白僵菌Beauveria bassiana侵染小菜蛾3龄幼虫对存活率的影响.通过平板对峙法检测PxG45对球孢白僵菌的抑制作用,进一步检测PxG45对植物病原真菌希金斯炭疽菌Colletotrichum higginsianum、刺盘孢炭疽菌C.camelliae、尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种 Fusarium oxysporum f.sp.cubense race 4、茄链格孢菌 Alternaria solani、稻瘟病菌 Magnaporthe oryzae和丁香假单胞菌杨梅致病变种Pseudomonas syringae pv.myricae的广谱抗性.[结果]小菜蛾3龄幼虫肠道菌PxG45为成团泛菌Pantoea agglomerans.与未饲喂PxG45的对照组相比,饲喂PxG45不仅显著提高了健康小菜蛾3龄幼虫的存活率,还提高了球孢白僵菌侵染后3龄幼虫的存活率.与PxG45拮抗培养的球孢白僵菌和6种植物病原真菌的菌落直径均显著小于单独培养球孢白僵菌和6种植物病原真菌时的直径,与PxG45拮抗培养后真菌的生长均被抑制.[结论]成团泛菌PxG45通过直接的抑菌作用影响小菜蛾对外界的适应性,且这种抑菌作用具备广谱性,可显著抑制植物病原真菌的生长.本研究表明PxG45具备生防菌潜力,并为利用害虫肠道共生菌提供新思路.

[背景]白僵蚕中的生物活性物质在医疗、保健品及化妆品行业有着广泛的应用.目前,许多人工养殖僵蚕基地在实际生产中使用的菌种多为未进行纯化优选的自然感病死亡僵蚕孢子粉且无固定的施用浓度,使得蚕的僵化死亡率难以保证.提高白僵菌菌株的致病力并筛选性状优良的高毒力菌株是工厂化生产白僵蚕研发的重要方向.[目的]利用紫外-微波复合诱变技术筛选高毒力菌株,为僵蚕工厂化生产提供优良菌株.[方法]利用孢子稀释法从山西省养殖农户中自然感染白僵菌的家蚕中分离获得一株原始白僵菌,运用紫外-微波复合的方式对该菌株进行诱变,并比较诱变前后菌株的产孢量及对家蚕的致病力.[结果]分离得到的原始菌株经鉴定为球孢白僵菌(Beauveria bassiana),命名为Beauveria bassiana Bb1003.通过对致死率和正突变率的考察,确定紫外-微波复合诱变的最佳诱变条件为紫外(功率为 15 W)照射 30 min,微波(功率为 800 W、额定微波频率 2450 MHz)辐照 60 s.筛选后得到 6 株复合诱变菌株(UMCM1、UMCM2、UMCM3、UMCM4、UMCM5 和UMCM6).菌株UMCM2 对家蚕的僵化率高达 97.64%,产孢量是原始菌株的 2.48 倍,对家蚕的致病能力显著高于原始菌株.[结论]利用紫外-微波复合诱变的方式成功筛选到高毒力菌株,为工厂化生产白僵蚕奠定了基础.

[目的]华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita是花生等多种农作物、果林及苗圃的重要害虫,长期以来主要以化学防治为主.本研究测定了球孢白僵菌Beauveria bassiana菌株JCF对华北大黑鳃金龟幼虫和成虫的致病力,为华北大黑鳃金龟的生物防治提供真菌资源.[方法]对罹患病害的华北大黑鳃金龟虫尸上的寄生真菌进行分离及回接试验,分离纯化出致病菌株JCF;利用光学显微镜观察菌株形态学特征,PCR扩增JCF的rDNA-ITS序列并测序,构建JCF系统发育树对菌株进行分子鉴定;采用浸渍法和田间模拟试验测定其对华北大黑鳃金龟成虫和幼虫的致病力.[结果]JCF菌株菌落初期为白色绒状,后期变为黄色或浅黄色絮状,背面无色.产孢细胞呈瓶状簇生于分生孢子梗上,分生孢子梗呈穗状,着生在营养菌丝上;分生孢子单生,透明,近球形,直径(2.0～3.5)μm×(1.5～2.0)μm.rDNA-ITS序列分子鉴定表明菌株JCF为球孢白僵菌.这一球孢白僵菌菌株JCF对华北大黑鳃金龟成虫的致死中浓度(medium lethal concentration,LC50)值为2.124 × 107孢子/mL,用其2 × 108,1 × 108和5 × 107孢子/mL孢悬液处理华北大黑鳃金龟成虫时,致死中时(medium lethal time,LT50)值分别为6.267,6.852和7.455 d;球孢白僵菌JCF菌株对华北大黑鳃金龟1,2和3龄幼虫的LC50值分别为5.47 ×106,1.59 ×108,2.50×108孢子/mL;1 × 108孢子/mL浓度下,球孢白僵菌JCF菌株对华北大黑鳃金龟1和2龄幼虫的LT50值分别为8.6和18.6 d;5 ×108孢子/mL浓度下,球孢白僵菌JCF菌株对华北大黑鳃金龟2和3龄幼虫的LT50值分别为10.3和13.2 d.田间模拟试验2 ×108孢子/mL球孢白僵菌JCF孢悬液对华北大黑鳃金龟成虫和幼虫同样表现出良好的致病效果.[结论]球孢白僵菌菌株JCF对华北大黑鳃金龟成虫和幼虫均有较高致病力,为开发白僵菌制剂防治金龟科害虫提供了新的菌种资源,对生物防治金龟科害虫具有潜在的应用价值.

[目的]筛选对暗黑鳃金龟Holotrichia parallela幼虫具高毒力的球孢白僵菌Beauveriabassiana菌株,并评价最高毒力菌株分别与印楝素和辛硫磷联合使用的模拟田间防效.[方法]采用浸虫法,通过试虫校正死亡率和致死中时(medium lethal time,LT50)值评价10株球孢白僵菌对暗黑鳃金龟3龄幼虫的毒力,并测定筛选出的Bb14菌株对暗黑鳃金龟1龄和3龄幼虫的致死中浓度(medium lethal concentration,LC50)值.将Bb14菌株孢子悬浮液(1 × 108孢子/mL)分别与印楝素(3 mg/L)和辛硫磷(200 mg/L)联用,通过温室盆栽实验评价其对烟草幼苗上暗黑鳃金龟3龄幼虫的防治效果.[结果]在1×108孢子/mL处理下,供试10株球孢白僵菌以Bb14菌株对暗黑鳃金龟3龄幼虫毒力最高,其导致的17 d累计校正死亡率为76.67％,LT50值为11.14 d.该菌株对暗黑鳃金龟1龄和3龄幼虫的LC50值分别为0.32 × 107和0.68 × 107孢子/mL.盆栽实验中药后25 d时,单独使用Bb14菌株、印楝素和辛硫磷对暗黑鳃金龟3龄幼虫的防效分别为42.86％,64.29％和82.14％,而当Bb14分别与印楝素和辛硫磷联用后,对暗黑鳃金龟3龄幼虫的防效分别达到78.57％和92.86％.[结论]供试10株球孢白僵菌中Bb14菌株对暗黑鳃金龟幼虫的毒力最高,该菌株与印楝素或辛硫磷联用能够提高对暗黑鳃金龟幼虫的防效.

目的 明确延胡索Corydalis yanhusuo不同组织器官中内生真菌菌群结构与多样性.方法 通过形态和分子手段相结合的方法对延胡索块茎、叶、茎、根中的内生真菌进行分离、鉴定及菌群结构分析.结果 共分离得到内生真菌2161株,根据菌株的形态学特征划分成106个形态型,分子鉴定为57个分类单元,归属到41个属,其中木霉属Trichoderma、毛链孢属Monilochaetes为块茎的专有属,腐霉属Pythium、白僵菌属Beauveria为叶的专有属,亚球壳属Sphaerulina、核瑚菌属Typhula为茎的专有属,小囊菌属Microascus为根的专有属;相似性分析表明,延胡索不同组织器官内生真菌组成结构上存在差异;Shannon-wiener多样性指数及Simpson指数分析显示延胡索根和茎中内生真菌多样性指数、丰度均显著高于块茎和叶.结论 延胡索组织器官中内生真菌资源丰富,为延胡索内生真菌资源的开发利用提供了基础资料和参考依据.

以人乳腺癌MDA-MB-231细胞筛选球孢白僵菌深层发酵液抗乳腺癌活性部位,并对其活性部位的成分进行初步分析.采用MTT法检测发酵液不同萃取部位抗乳腺癌活性;通过细胞形态观察进一步了解活性萃取部位对细胞生长的影响;采用LC-MS/MS对活性部位的成分进行分析.实验结果显示:球孢白僵菌深层发酵液乙酸乙酯萃取部位对MDA-MB-231细胞生长的抑制作用最强且呈量效和时效关系(P＜0.05),作用24h的IC50值为197.84μg/mL;细胞形态观察显示乙酸乙酯萃取部位浓度在200μg/mL时,对MDA-MB-231细胞的凋亡作用随着时间的延长而加强;LC-MS/MS数据初步表征了其中的18个化学成分,初步鉴定了其中的15种成分,其中13种成分首次从球孢白僵菌中得到鉴定,其他3个物质虽未能初步鉴定,但亦对其分子量及分子式进行了初步的表征.乙酸乙酯部位是球孢白僵菌深层发酵液抗乳腺癌MDA-MB-231细胞的主要活性部位,能抑制MDA-MB-231细胞生长并诱导细胞凋亡,初步鉴定了其中15种成分,为进一步开发利用球孢白僵菌药用资源提供科学依据.