旨在揭示木薯MeTPS9基因在干旱、低温、遮荫等非生物胁迫应答中的作用.用RT-PCR的方法从木薯叶片中克隆MeTPS9基因(GenBank登录号:MF276889),用MEGA软件构建系统进化树,用DnaSP软件分析基因结构变异,用PlantCARE分析启动子元件,用荧光定量PCR技术分析MeTPS9在不同组织中以及响应不同非生物胁迫的表这特性.结果显示,从木薯中克隆了一个TPS基因MeTPS9.该基因具有2 598 bp的开放阅读框,编码865个氨基酸,含有TPS家族保守结构域.系统进化树分析表明,MeTPS9与荠菜花和拟南芥中同源基因的亲缘关系较近,序列相似性分别为76.2％和75.6％.基因结构变异发现,木薯野生种和栽培种之间共有66个突变位点,其中11个为错义突变.启动子元件分析表明,MeTPS9含有干旱相关元件MBS、低温相关元件LTR、热胁迫相关元件HSE、以及ABA相关元件ABRE.实时荧光定量PCR分析表明,MeTPS9的表达量在须根中最高,在叶片中最低.而且,MeTPS9基因的表达能被干旱、低温、和遮荫处理显著诱导.MeTPS9在转录水平对木薯干旱、低温、和遮荫胁迫起调控作用,可作为候选基因进一步研究其在木薯抗逆中的作用.

蔗糖在植物的生长过程中发挥至关重要的作用,蔗糖磷酸合成酶(SPS)是蔗糖合成的关键限速酶.生物信息分析显示,在谷子中,SPS-Si000130m与海藻糖6-磷酸合成酶基因TPS-Si016303m、尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因UGD-Si035452m存在显著的相互作用.高通量测序对谷子3种基因的表达谱研究进一步表明,在谷子根、茎、叶、穗中SPS-Si000130m基因与TPS-Si016303m基因的表达模式呈正相关,与UGD-Si0354-52m基因的表达模式呈负相关.但无论是正相关还是负相关,TPS-Si01 6303m和UGD-Si035452m沿谷子叶片梯度的表达模式均与SPS-Si000130m基因存在差异.SPS-Si000130m的表达集中在叶片光合作用的功能部位,而TPS-Si016303m的转录物在叶片梯度各部位均可检测到,可见即使这两个基因呈现正相关,它们之间仍存在自身独特的表达、调控特点;负相关基因(即UGD-Si035452m和SPS-Si000130m)沿叶片梯度相反的表达模式则反映出植物通过基因表达的区域化,避免这两个酶彼此竞争相同底物,防止无效循环的进行.进一步通过生物信息学软件预测三种蛋白的功能结构域和3D结构则显示,SPS-Si000130m和TPS-Si016303m之间存在相同功能结构域—糖基转移酶功能结构域;而SPS-Si000130m和UGD-Si035452m之间没有相同功能结构域.总之,深入研究3种蛋白功能和结构的特点及它们之间的相互作用,将加深对谷子糖类代谢调控网络的认识,并有助于我们改善谷子品质的研究.

[目的]海藻糖合成酶(trealose-6-phosphate synthase,TPS)是海藻糖合成过程中的关键酶之一.本研究旨在克隆沙葱萤叶甲Galeruca daurica海藻糖合成酶基因,分析其对不同温度胁迫的响应,以期进一步揭示沙葱萤叶甲耐温性的分子调控机制.[方法]通过RACE技术克隆沙葱萤叶甲TPS基因的全长cDNA序列,并对该基因进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR方法检测TPS基因在不同温度下沙葱萤叶甲2龄幼虫中的表达量变化.[结果]克隆获得沙葱萤叶甲TPS基因,将其命名为GdTPS(GenBank登录号:KY460114),该基因全长2 706 bp,开放阅读框(ORF)长2 496 bp,编码831个氨基酸;蛋白预测分子量为94.05 kD,等电点为6.82,无信号肽和跨膜结构,包含3个N-糖基化位点.GdTPS有两个保守功能区,与其他昆虫TPS具有较高的同源性,其中与马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata TPS亲缘关系最近,氨基酸序列一致性为88％.实时荧光定量PCR结果表明,温度低于25℃(对照)时,GdTPS表达量随着温度下降而上升,-10℃时达到最高值;高于25℃时,GdTPS表达量随着温度上升而上升,40℃时达到最高值.[结论]沙葱萤叶甲幼虫通过上调GdTPS的表达来应对高温和低温胁迫,该结果为揭示TPS在昆虫应对温度胁迫过程中作用的分子机制提供了基础.

海藻糖广泛存在于细菌、真菌、动物和植物中.它不仅作为能量储备物质,在外界环境胁迫或内部代谢紊乱时,也可作为保护因子,保护其生命体度过逆境.昆虫海藻糖合成酶与海藻糖酶分别是海藻糖合成与分解的关键酶,合成的海藻糖在海藻糖转运蛋白的帮助下由胞内进入胞外.胰岛素与脂动激素直接参与昆虫糖代谢,保幼激素与蜕皮激素通过和胰岛素与脂动激素通路偶联,间接参与调控昆虫海藻糖代谢.海藻糖代谢途径和昆虫生长发育密切相关,昆虫海藻糖代谢信号通路为开发害虫控制的新靶标提供理论依据.

海藻糖-6-磷酸合成酶(Trehalose-6-phosphate synthase)基因TPS是海藻糖生物合成途径中的关键基因之一.该研究从矮牵牛(Petuniah ybrida)中分离了TPS5的同源基因PhTPS5.该基因开放阅读框(ORF)为2 595bp,编码864个氨基酸.推测PhTPS5蛋白的分子式为C4363H6825N1173O1289S37.组织特异性表达分析显示:PhTPS5基因在根中表达量最高,叶片中的表达量最低;去顶6h能够显著促进PhTPS5基因的表达,但24 h后表达量明显下降;去顶后施加生长素则能够有效抑制去顶对PhTPS5基因表达的调节;施加细胞分裂素6h后PhTPS5基因的表达水平显著上调,但随着处理时间的增加,其表达水平有所下降.该研究为进一步揭示TPS途径在矮牵牛分枝发育中的调控机制奠定了理论基础.

[目的]通过比较柑橘大实蝇Bactrocera minax蛹滞育期与滞育前和滞育后以及滞育蛹与非滞育蛹体内海藻糖和葡萄糖含量的变化、海藻糖合成代谢途径中关键酶的活力变化以及关键酶基因的表达量变化,明确蛹滞育期间海藻糖合成代谢途径中关键酶对海藻糖含量的调控.[方法]利用分光光度法检测柑橘大实蝇滞育前(1日龄蛹)、滞育期(30,60和90日龄蛹)以及滞育后(120和150日龄蛹)蛹体内海藻糖与葡萄糖含量的变化,以及海藻糖合成代谢途径中的海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)、海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶(TPP)和海藻糖酶(Tre)活力的变化;利用实时定量荧光PCR (qPCR)检测TPS,TPPB,TPPC-1,TPPC-2和Tre-1基因表达量的变化.向1日龄蛹体内注射20-羟基蜕皮酮(20E)作为处理(以注射10％乙醇为对照),分别于注射后1和30 d比较处理组与对照组蛹体内海藻糖与葡萄糖含量、关键酶活力以及上述基因表达量的差异.[结果]柑橘大实蝇蛹进入滞育后,海藻糖含量显著升高,葡萄糖含量无显著变化;TPS和TPP的酶活力以及TPS,TPPC-1和TPPC-2表达量在化蛹后逐渐升高,于滞育期达到最高水平,维持至羽化前显著下降;TPPB表达量在整个蛹期无显著差异;Tre酶活力以及Tre-1表达量在化蛹后逐渐升高,于滞育早期达到最高水平,随后显著下降,羽化前再次显著上升.注射20E后1d,与对照组相比,处理组蛹体内海藻糖与葡萄糖含量、关键酶(TPS,TPP和Tre)活力以及TPS,TPPC-2和Tre-1表达量无显著变化,TPPB表达量显著下降,TPPC-1表达量显著上升;注射后30 d,与对照组滞育蛹相比,处理组非滞育蛹海藻糖含量显著上升,葡萄糖含量、TPS和Tre酶活力、TPS和Tre-1表达量显著下降,TPP酶活力以及TPPB和TPPC-2表达量无显著差异.[结论]柑橘大实蝇蛹体内海藻糖的含量在合成代谢途径中关键酶的调控下,随着滞育状态发生变化,表明海藻糖与滞育之间存在密切的关系,但其作用机理仍待进一步研究.

卷柏为典型极端耐旱的复苏药用植物,海藻糖在植物复苏过程中发挥重要作用,海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)是植物体内合成海藻糖的关键酶.该研究根据卷柏转录组数据拼接获得海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列,以卷柏总RNA为模板合成cDNA,采用RT-PCR法克隆验证该序列,并进行生物信息学分析,结果显示该序列编码区长2 799 bp(St TPS,GenBank号MH155231),编码932个氨基酸,无信号肽,StTPS可能定位于叶绿体上且无跨膜结构,包含2个糖原磷酸化酶糖基转移酶(GPGTF)家族的保守结构域.在此基础上,模拟卷柏复苏(脱水和复水)过程,应用qRT-PCR进行其在复苏过程中的表达量分析,并同步采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)测定卷柏复苏过程中海藻糖含量变化.结果显示StTPS基因相对表达量及海藻糖含量均随着脱水时间的延长而增加,随着复水时间的延长而下降,且二者之间呈正相关,初步说明StTPS在卷柏复苏过程中发挥重要作用.

福寿螺是国际自然保护联盟(IUCN)公布的全球100种恶性外来物种之一,严重破坏入侵地农作物生产和水生生态系统稳定,并可作为广州管圆线虫中间宿主传播疾病.福寿螺生态适应性强,在入侵地缺少天敌,一旦定殖形成稳定种群后防制十分困难.研究福寿螺生态适应性机制对科学防制福寿螺具有重要意义.与其他螺群相比,福寿螺功能基因的研究尚未得到足够的关注,关于其生态适应性分子机制的研究相对较少.本文综述了国内外关于福寿螺生态适应性机制相关功能基因的研究进展,包括热休克蛋白、海藻糖合成酶、多功能纤维素酶、蛋白质神经毒素2、细胞色素P450酶系等基因.这些研究结果部分揭示了福寿螺在温度、食物、捕食者、灭螺药物等环境条件影响下自身的适应性变化趋势,但更多内在调节机制尚有待深入研究.

目的 优化灰色链霉菌海藻糖合成酶(Trehalose synthase,TreS)基因密码子,提高海藻糖合成酶大肠杆菌基因工程菌株表达水平.方法 基于大肠杆菌基因组密码子偏好数据表对tres基因进行密码子优化得基因tres1.基因工程法构建分别含tres及tres1基因的表达载体pET-26b(+)-tres和pET-26b(+)-tres1,CaCl2法转入大肠杆菌BL21(DE3)获得表达海藻糖合成酶的大肠杆菌基因工程菌株,采用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对摇瓶发酵粗酶液进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析及酶活性测定以确定表达水平.结果 1707 bp海藻糖合成酶tres基因共优化碱基序列268 bp,优化后序列的GC含量由65.8％降低至54.4％,密码子适应指数(CAI)由0.37提升至0.97,SDS-PAGE及酶活性分析表明,含pet-26b(+)-tres1表达载体的大肠杆菌基因工程菌株海藻糖合成酶蛋白表达量高,酶活性比含pet-26b(+)-tres工程菌提高60.3％ 以上.结论 密码子优化可有效提高海藻糖合成酶TreS蛋白在大肠杆菌中的表达,为海藻糖合成酶的异源高效表达提供了重要参考.

在昆虫中已发现成熟的典型胰岛素信号通路,但是其调控海藻糖代谢途径的机制还未清晰.为探讨胰岛素受体基因在褐飞虱海藻糖代谢平衡及其发育的调控作用,本文采用RNAi技术抑制胰岛素受体(InR)基因的表达,测定处理后海藻糖、糖原和葡萄糖含量及海藻糖酶活变化,并检测InR、类胰岛素多肽(Ilp)、海藻糖代谢途径中关键基因的表达.研究结果表明dsRNA注射后能够显著抑制Ilp和InR基因的表达;InR1低表达后72 h能够显著抑制3种糖类物质的含量;InR表达抑制后72 h可溶性海藻糖酶活性上升,而膜结合型海藻糖酶活性下降;当InR表达受抑制后3个海藻糖酶和2个海藻糖合成酶基因的表达都显著下降.这些结果说明InR能够影响海藻糖等糖类物质的平衡.从而为将来通过调控昆虫血糖平衡来控制害虫提供理论依据.