目的:利用狂犬病毒糖蛋白（RVG）修饰的外泌体与超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPION）构建神经靶向分子探针RVG-Exo-SPION，研究其表征及体外磁共振成像（MRI）效果。方法:构建RVG-Lamp2b质粒并转染HEK293细胞，提取膜表达RVG的外泌体，电穿孔与SPION合成磁性分子探针RVG-Exo-SPION。采用免疫印迹、透射电镜分析（TEM）、纳米粒径追踪分析（NTA）及体外毒性分析（CCK-8法）方法分别对分子探针外泌体膜蛋白表达、形状、尺寸和生物相容性进行分析和鉴定，并通过激光共聚焦成像、普鲁士蓝染色和MRI联合评估Neuro-2A细胞对分子探针的摄取能力。结果:双酶切法证明目的基因重组至pcDNA3.1质粒中，免疫印迹显示重组质粒被有效转染至HEK293细胞，外泌体标记蛋白CD9和CD63呈高表达。TEM显示修饰和电穿孔后的外泌体保持其正常的形状、尺寸和膜结构，外泌体电穿孔后能见到SPION的存在。NTA显示工程化的外泌体粒径分布窄，粒径分布峰值为140 nm。Neuro-2A细胞与1~100 mg/L不同浓度梯度的RVG-Exo-SPION共同孵育时，细胞的活力差异无统计学意义（均 P>0.05）。激光共聚焦显微成像分析显示外泌体能高效地进入细胞，线形图显示实验组荧光强度更高；普鲁士蓝染色验证了RVG-Exo-SPION对Neuro-2A细胞的靶向能力，靶向组的阳性细胞标记率明显高于对照组[（75.8±5.6）%比（19.1±2.5）%）， P<0.05]；体外MRI显示灰阶值在不同铁浓度（5、10、25、50、100 mg/L）之间有明显区别，且在Fe≥25 mg/L的浓度下易于识别。 结论:基于RVG修饰外泌体构建的磁性分子探针RVG-Exo-SPION在体外实验中具有较好的稳定性和神经靶向性，为进一步用于体内研究提供了可行性。

目的 采用多聚赖氨酸修饰的超顺磁性氧化铁(Polylysine coated superparamagnetic iron oxide,PLL-SPIO)纳米颗粒标记兔脂肪间充质干细胞(Adipose derived stem cell,ADSCs),探讨不同SPIO浓度及孵育时间对ADSCs标记率、存活率及细胞增殖率的影响,筛选SPIO标记ADSCs的最优标记条件.方法 用含不同浓度的SPIO(12、25、50 μg/mL)培养基培养第3代兔ADSCs,分别孵育不同时间(6、12、24、48 h),孵育完成后,普鲁士蓝染色计算细胞标记率;细胞毒性实验检测细胞存活率;根据细胞毒性实验结果筛选细胞存活率较大的6组细胞进行细胞增殖能力检测,检测细胞增殖率.结果 普鲁士蓝染色结果显示,各组细胞标记率及细胞内蓝染颗粒数量,随着SPIO浓度增大及孵育时间的延长而增多.细胞毒性实验结果显示,在较低SPIO浓度和较短孵育时间下,细胞存活率不受影响,且各组之间细胞存活率无明显差异,随着SPIO浓度增大及孵育时间延长,细胞存活率呈下降趋势,48 h时细胞存活率下降最明显.细胞增殖实验结果显示,实验组各组细胞增殖率,随SPIO浓度增大及孵育时间延长而降低;且细胞进入快速增长期后,实验组细胞增殖率与阴性对照组相比,均存在明显差异,其中12 μg/mL SPIO-6 h组和25 μg/mL SPIO-6 h组细胞增殖率与阴性对照组差异较其他各组小.结论 从细胞内SPIO颗粒含量及细胞标记率、存活率及增殖率几方面综合评价,25 μg/mL SPIO孵育6 h,是本研究所选出的PLL-SPIO 标记ADSCs的最优标记条件.

目的:探索新的体外构建血管网络的方法以解决工程化骨组织预血管化的问题.方法:冻存颌骨来源成骨细胞(human osteoblasts,HOBs)和人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)用 0,5,25,50 μg/mL四氧化三铁纳米颗粒(Fe3O4 MNPs,magnetic nanoparticles)孵育;CCK-8试剂盒、普鲁士蓝染色检测不同浓度Fe3O4 MNPs对冻存颌骨来源HOBs和HUVECs生长、内吞的影响.采用50 μg/mL Fe3O4 MNPs孵育HOBs和HUVECs,第 0,1,3天用活/死细胞双染色试剂盒检测细胞存活情况.采用50 μg/mL Fe3O4 MNPs孵育HOBs和HUVECs不同时间(0,30 min,1 h,2 h)后,N41超磁铁皿底吸引,鬼笔环肽(phalloidin)细胞骨架染色检测HOBs和HUVECs贴壁成膜情况;采用50 μg/mL Fe3O4 MNPs孵育HOBs和HUVECs 1 h后,磁性吸引控制依次成膜,设置HOBs+HOBs 对照组,HOBs+HUVECs+HOBs 预血管化组;3,3-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate(DiO)和 1,1'-Di-octadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate(DiL)分别标记 HOBs 和 HUVECs 后荧光显微镜观测示踪,第3、7天利用Western blot、免疫荧光染色检测预血管化细胞膜片人骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP2)和血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)蛋白表达水平及染色阳性分布区域.结果:与细胞对照组相比,5 μg/mL组,25 μg/mL组,50 μg/mL Fe3O4 MNPs组HOBs和HUVECs生长无显著差异.与对照组相比,50 μg/mL Fe3O4 MNPs组HOBs和HUVECs纳米颗粒内吞明显,HOBs和HUVECs存活无差异.与未标记对照组及孵育30 min组相比,50 μg/mL Fe3O4 MNPs孵育HOBs和HUVECs 1 h和2 h组明显可见较多细胞贴壁成膜.与HOBs+HOBs对照组相比,HOBs+HUVECs+HOBs预血管化组呈现明显三明治状分层结构,膜片厚度明显增加,VEGF-A和BMP2蛋白表达及染色阳性显著增加.结论:通过纳米颗粒标记并磁性吸引成膜,体外形成预血管化成骨细胞膜片,为优化构建预血管化的骨组织提供了新的理论指导.

背景:炎症、氧化应激及细菌感染是糖尿病创面难愈合的主要原因,近年来各种无机纳米材料以其抗菌活性被广泛应用于皮肤创面愈合的治疗,但抗氧化和抗炎方面的作用有限.目的:考察普鲁士蓝纳米颗粒在抗氧化、抗炎和光热抗菌多方面的糖尿病创伤修复的效果.方法:制备普鲁士蓝纳米颗粒并进行表征.①体外实验:采用MTT法检测不同浓度普鲁士蓝纳米颗粒的生物相容性;在过氧化氢条件下,检测普鲁士蓝纳米颗粒的细胞保护作用及活性氧荧光表达;检测普鲁士蓝纳米颗粒分解过氧化氢和超氧阴离子自由基的能力;考察普鲁士蓝纳米颗粒抑制脂多糖诱导巨噬细胞炎症的作用;采用平板菌落计数法检测普鲁士蓝纳米颗粒的光热抗菌能力.②体内实验:腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病ICR小鼠模型,使用打孔器在背部建立直径6 mm全厚皮肤创面,分对照组(未给予治疗)、普鲁士蓝组及普鲁士蓝光照组干预,观察创面愈合与组织形态学变化.结果与结论:①体外实验:普鲁士蓝纳米颗粒在25-200 μg/mL质量浓度下对细胞无毒性;普鲁士蓝纳米颗粒具有极强的抗氧化能力,能够抑制氧化应激条件下过度活性氧的产生及对细胞的杀伤,对过氧化氢有降解活性且具有很强的清除超氧阴离子自由基的能力;普鲁士蓝纳米颗粒还显示出显著的抗炎活性,并且在光照后显示出极强的抗菌能力.②体内实验:造模14 d后,普鲁士蓝组、普鲁士蓝光照组创面明显缩小,其中普鲁士蓝光照组创面愈合速度最快.苏木精-伊红和Masson染色显示,普鲁士蓝组、普鲁士蓝光照组创面可见大量的肉芽组织形成及胶原沉积,其中以普鲁士蓝光照组最多;免疫荧光染色显示,与对照组比较,普鲁士蓝组和普鲁士蓝光照组α-SMA和CD31表达明显增多(P<0.05),F4/80表达明显减少(P<0.05),其中以普鲁士蓝光照组改善更明显.③结果表明,普鲁士蓝纳米颗粒通过发挥抗炎、抗氧化及抗菌作用促进糖尿病小鼠模型皮肤创面的愈合.

目的 本研究合成了一种新型光化联合纳米载药系统,以期为舌鳞癌综合治疗提供新的策略.方法 通过水热合成法及盐酸蚀刻法,制备介孔普鲁士蓝纳米粒子(PBNP's);用透明质酸-聚乙二醇共聚物(HA-PEG)进行修饰实现肿瘤主动靶向,形成PBNP's-HA-PEG(简称PH);继而装载顺铂纳米颗粒,完成新型纳米给药体系Nano CDDP/PBNP's-HA-PEG(简称NCPH)的制备;随后对该体系粒径分布、靶向性、药物释放性能及光敏特性等进行表征;最后进行体内外抑瘤实验及生物安全性评价.结果 PH粒径在100 nm左右,靶向性良好,光热性能稳定,光照条件下可加快药物释放速度;体内外抑瘤试验结果表明NCPH在一定浓度范围内可以显著抑制体内外肿瘤生长;生物安全性评估发现,该载药系统毒副作用小,耐受性良好.结论 成功制备了新型载药系统NCPH,实现了抗舌鳞癌的光化联合治疗,生物安全性良好.

目的:探讨间充质干细胞(MSCs)经鼻内途径移植对创伤性脑损伤(TBI)的定向精准修复作用.方法:75只雄性SD大鼠按随机数字表法分为假手术对照组、模型对照组、患处MSCs移植组、鼻内MSCs移植组、尾静脉MSCs移植组,每组15只.采用改良式自由落体法制备中度TBI模型,分别以患处、鼻内、尾静脉途径移植MSCs(5×105个/只).移植后第1、第7天通过改良神经功能缺损评分(mNSS)了解大鼠神经功能恢复情况;解剖观察脑组织恢复情况;比较各组脑脏器系数;普鲁士蓝染色观察超顺磁性纳米铁颗粒(SPIO)标记的MSCs经鼻内途径入颅情况;HE染色观察各组大鼠脑组织病理学改变情况.结果:mNSS结果显示,模型对照组术后第1、第7天mNSS评分明显高于假手术对照组(P＜0.01).与模型对照组比较,MSCs移植各组术后第1、第7天mNSS均显著降低(P＜0.01).解剖观察显示,与模型对照组比较,移植后第7天MSCs移植各组大鼠脑创面均有明显改善.与假手术对照组比较,移植后第1天模型对照组脑脏器系数显著升高(P＜0.05);与模型对照组比较,患处及鼻内MSCs移植组脑脏器系数显著降低(P＜0.01).普鲁士蓝染色显示,患处及鼻内MSCs移植组大鼠脑组织可见大量SPIO标记的MSCs.组织病理学结果显示,与模型对照组比较,移植后第7天患处及鼻内MSCs移植组大鼠脑组织损伤减轻.结论:MSCs经鼻内途径移植对TBI具有较好的修复作用,可为临床应用提供一定的理论依据.

目的 探讨由核酸适配体介导的新型靶向铁磁纳米颗粒增强上皮细胞黏附分子(EpCAM)阳性肿瘤细胞热疗效应的作用.方法 利用生物素与链霉亲和素的亲合作用将EpCAM核酸适配体SYL3C与铁磁纳米颗粒连接构建核酸适配体-铁纳米粒复合物(AptNPs),应用动态光散射粒径仪评估其直径大小,普鲁士蓝染色观察AptNPs对EpCAM阳性肿瘤细胞的靶向结合特性,乳酸脱氢酶检测AptNPs在交变电磁场作用下对EpCAM阳性肿瘤细胞的热杀伤效应,吖啶橙/溴化乙锭双染观察其引起EpCAM阳性肿瘤细胞的凋亡情况.结果 生物素-链霉亲和素将SYL3C与铁磁纳米颗粒连接成功构建AptNPs,AptNPs直径为282 nm.流式细胞仪检测和普鲁士蓝染色显示,AptNPs对EpCAM阳性肿瘤细胞有较强的选择结合特异性,对EpCAM阴性肿瘤细胞结合较弱.在交变电磁场加热5h后,1.5×108个AptNPs使EpCAM阳性细胞HCT116存活率仅为28.9％,A549细胞为54.4％,与EpCAM阴性细胞HepG2细胞(76.7％)比较,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 AptNPs可以靶向性地提高对EpCAM阳性肿瘤细胞热疗的效应,在肿瘤靶向治疗新策略中具有潜在的应用价值.

目的 探索使用PEI-Fe3O4纳米颗粒标记人羊膜上皮细胞(hAEC).方法 采用透射电子显微镜和动态光散射表征PEI-Fe3O4纳米颗粒.使用纳米颗粒标记原代培养的hAEC,普鲁士蓝染色评价其标记效率,台盼蓝染色法和CCK-8法检测细胞存活率和细胞毒性.结果 PEI-Fe3O4纳米颗粒呈紧凑的球形,平均粒径为13 nm,水动力学半径为17.56nm,zeta电位为+34.5 mV.浓度大于20μg/ml的纳米颗粒对hAEC的标记效率达到91％.50(t=16.37,P＜0.0001;t=10.39,P＜0.0001)、100 μg/ml(t=29.89,P＜0.0001;t=16.86,P＜0.0001)纳米颗粒浓度下的hAEC存活率和细胞活力均明显低于未标记时.结论 PEI-Fe3O4纳米颗粒可用于标记hAEC,在其工作浓度下未表现出显著的细胞毒性.

目的 探讨anti-EGFR-PEG-SPIO纳米分子探针对表皮生长因子受体(EGFR)高表达肺腺癌细胞的靶向性及利用MRI对其监测的可行性.方法 制备anti-EGFR靶向纳米分子探针(anti-EGFR-PEG-SPIO)及非靶向纳米分子探针(PEG-SPIO),行电镜(TEM)观察,并测量水合粒径及弛豫率等表征.之后将不同Fe浓度(0、10、20、40、60、80μg/ml)的anti-EGFR-PEG-SPIO和PEG-SPIO分别与H460细胞孵育2h后,进行体外MR成像,观察其T2WI信号强度及信号强度变化率.行H460细胞普鲁士蓝染色和电镜观察细胞摄取Fe情况.结果 不同Fe浓度anti-EGFR-PEG-SPIO及PEG-SPIO探针分别与H460细胞孵育2h后,前者显示H460细胞的信号强度随Fe浓度的升高而明显减低,Fe浓度为60 μg/ml时,相对于0、10、20、40、80 μg/ml,信号强度变化率约为58.2％、-82.7％、-94.4％和-98.3％;而后者显示H460细胞信号强度减低相对不明显.普鲁士蓝染色及TEM结果显示anti-EGFR-PEG-SPIO的H460细胞内可见大量铁颗粒沉积,而PEG-SPIO的肿瘤细胞内仅可见少量铁颗粒沉积.结论 自行制备的anti-EGFR-PEG-SPIO分子探针对H460肺腺癌细胞具有靶向效应,采用3.0T MR扫描仪可对其进行监测.

目的 探讨MRI活体示踪慢性脑缺血SD大鼠颅内移植聚乙二醇/聚乙烯亚胺修饰的超顺磁性氧化铁(PEG/PEI-SPIO)标记脂肪源性干细胞(ADSCs)的可行性.方法 将双侧颈总动脉永久性结扎6个月后的30只SD雌性大鼠分为PEG/PEI-SPIO标记干细胞移植组(n=15)及未标记干细胞移植组(n=15),向2组模型鼠右侧脑室注射入标记或未标记ADSCs悬液.于移植术后第7天、14天、21天每组各选取5只模型大鼠行颅脑MR成像,于T2-mapping图像上测量2组颞顶叶皮质、海马、小脑的T2值.之后处死动物,对脑组织进行普鲁士染色,于高倍镜下计数蓝染细胞数,对T2值和蓝染细胞数行统计学分析.结果 T2WI、T2* WI、SWI可见2组大鼠颞顶叶皮质及海马散在类圆形低信号区.移植后第14天,标记细胞移植组右侧颞顶叶皮质、右侧海马的T2值较未标记细胞移植组缩短(P=0.013、0.045).移植后第21天,标记细胞移植组右侧颞顶叶皮质T2值较未标记细胞移植组缩短(P=0.007).移植后第14天右侧颞顶叶皮质及右侧海马,第21天右侧颞顶叶蓝染颗粒数量2组间差异有统计学意义(P=0.029、0.043、0.032).结论 于大鼠侧脑室移植PEG/PEI-SPIO标记的ADSCs可向慢性脑缺血所致病变区域迁移;采用量化MRI活体示踪移植PEG/PEI-SPIO标记ADSCs,可评估慢性脑缺血模型大鼠脑内迁移和分布.