目的:分析并监测Omicron株新型冠状病毒灭活疫苗毒种遗传稳定性。方法:毒种通过不同的方式，即未经过空斑纯化的毒种和空斑纯化的毒种，在细胞上进行连续传代后，收获细胞培养上清提取病毒核酸，利用二代测序进行病毒宏转录组分析，比较不同条件下Omicron株新型冠状病毒灭活疫苗毒种的全基因组突变位点及突变频率和插入/缺失的差异。结果:空斑纯化毒种连续传代后，ORF1ab和S基因序列上的高于5%的突变位点明显少于未经空斑纯化的毒种，且在纯化毒种全基因组中未检测到插入/缺失突变。结论:通过二代测序技术，分析不同路径的毒种连续传代样本的全基因组序列，结果表明毒种经过空斑纯化后的遗传稳定性优于未纯化毒种，为灭活疫苗研发毒种的选育提供了科学依据。

蝙蝠是许多人畜共患病病毒的储备宿主。但是关于个体蝙蝠内病毒的多样性和丰度的了解还较少，因此它们之间病毒共感染和溢出的频率也不清楚。我们用无偏的元转录组学方法，对中国云南省采样的149只个体蝙蝠中携带的哺乳动物相关病毒进行了表征。结果显示研究的动物中病毒的高频共感染(即蝙蝠个体同时感染多种病毒物种)和溢出，这可能进一步促进病毒的重组和再组合。值得注意的是，我们确定了5种病毒种，根据其与已知病原体的系统发生关系或体外受体结合实验的结果，发现这些病毒很可能对人类或牲畜具有致病性。这包括一种与SARS-CoV和SARS-CoV-2密切相关的新型重组SARS-like冠状病毒。体外实验表明，这种重组病毒可以结合人ACE2受体，可能具有更高的潜在溢出风险。我们的研究强调了蝙蝠病毒共感染和溢出现象的普遍发生及其对病毒出现的影响。

目的:了解贵州省布鲁氏菌分离株的多位点序列分型（multi-locus sequence typing，MLST）基因特征。方法:以2017-2021年贵州省布鲁氏菌分离株（保存于贵州省疾病预防控制中心菌毒种库）为研究对象，应用BCSP31-PCR方法进行布鲁氏菌属特异性鉴定，AMOS-PCR方法进行布鲁氏菌种/型鉴定；应用MLST方法进行基因分型，并采用Bionumerics 8.0软件对分型结果进行聚类分析。结果:贵州省分离的32株布鲁氏菌，经BCSP31-PCR方法和AMOS-PCR方法鉴定为羊种布鲁氏菌；经MLST方法分析，可以分为2种ST型（ST8、ST39型），其中ST8型28株（87.5%）、ST39型4株（12.5%）。ST8型菌株分布在省内7个市（州），ST39型菌株仅在黔西南布依族苗族自治州发现。聚类分析结果显示，ST8、ST39型菌株与羊种布鲁氏菌参考株聚在1个群内，且ST39型与ST8型菌株仅在glk基因内存在1个核苷酸位点差异，亲缘关系较近。结论:羊种布鲁氏菌是近年来贵州省布鲁氏菌病疫情的主要病原体，ST8型是贵州省羊种布鲁氏菌的优势MLST基因型。

目的:建立基于神经氨酸酶(neuraminidase，NA)活性检测细胞基质流感疫苗病毒滴度的新方法，并进行初步应用。方法:对NA活性检测使用底物的浓度和终止液类型、病毒感染靶细胞数目以及细胞裂解剂等反应条件进行优化，采用建立的方法检测细胞基质培养的流感疫苗毒种的病毒滴度，并与传统的病毒滴定法检测结果进行比较。结果:NA活性检测法的最适底物浓度为25 μmol/L，最适终止液为0.2 mol/L Na 2CO 3。细胞数目为4×10 4个/孔，病毒感染48 h后，用0.5% TritonX-100裂解，检测细胞内复制病毒的NA活性，产生的相对荧光值最大。检测4批细胞基质培养的流感疫苗毒种病毒滴度，该方法与传统病毒滴定法检测结果差异无统计学意义( P>0.05)，具有较好的一致性。 结论:本研究建立了基于NA活性检测细胞基质流感疫苗病毒滴度的新方法，可用于生产过程中细胞基质流感病毒毒种的检定。

新发微生物与感染杂志(Emerging Microbio and Infection)在国际上首次报道中国研究团队关于白蛉(Sandfly)微生物组(microbiome)的研究结果，题目为"感染组学研究揭示被忽视的吸血媒介白蛉所携带对人类具有致病性的病毒、细菌和真核微生物"。研究结果显示，我国山西省中部和南部地区自然界采集的白蛉标本中微生物组RNA占标本中总的非核糖体RNA的1.8%，共含有87种病原体，其中70种是新物种。RNA病毒在病原体中占比最多，其次是细菌、DNA病毒和真核微生物。RNA病毒包括15个超群(viral super-groups)，共78种，其中66种是RNA病毒中的新病毒种。在RNA病毒序列信息中包含大量已经在当地白蛉中分离到的白蛉病毒属(Genus Phlebovirus)的Wuxiang病毒(Wuxiang virus, WUXV)和Hedi病毒(Hedi virus, HEDV )两种新病毒的基因组信息。分析中发现2种DNA病毒(Adintovirida和细小病毒科病毒)。细菌基因组信息包括不动杆菌(Acinetobacter)、假单胞菌(Pseudomonas)、立克次体(Rickettsia)和沃尔巴克氏菌(Wolbachia)。在10批白蛉标本中至少5批标本存在利什曼原虫。此外还发现一种锥虫科(Trypanosomatidae)新成员。病毒基因组分子遗传进化分析结果显示，RNA病毒中存在黄病毒属(Flavivirus)病毒的新成员，该病毒与蚊虫相关病毒，如广平病毒(Quang binh virus)、细胞融合病毒(Cell fusing agent virus)和伊蚊黄病毒(Aedes flavivirus)等相聚类。综上结果提示自然界白蛉中不仅携带多种可以在组织培养细胞复制的病毒分离物，还携带病毒以外的多种细菌、立克次体和利什曼原虫等。这一研究首次报道自然界白蛉的微生物感染组学结果，对于了解白蛉携带和传播病原微生物及其所带来的公共卫生危害有了较深入的认识，同时这种应用还可以扩展到其他媒介物种，从而将更有效地发现和表征媒介中的潜在病原体。

目的 评价生产场地变更对水痘减毒活疫苗质量的影响.方法 采用新一代基因测序技术(next-generation sequencing,NGS).将生产场地变更前后的水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)Oka株毒种(VW-前、SYVW-后)与水痘减毒活疫苗原液(P-前、YZP-后)经DNA抽提、纯化、建库和测序,并对测序结果进行质量评价.以GenBank中登录的Dumas株基因序列(NC_001348)作为位置参考基因组,将生产场地变更前后4个样品全基因序列进行对比,从突变位点、碱基组成及突变频率(variant allele frequency,VAF),评价生产场地变更前后样品的一致性.结果 4个样品的测序深度均＞1 500 ×,毒种及疫苗原液GC含量均约46％,测序质量较高.生产场地变更前后毒种及疫苗原液的突变位点和碱基组成一致,且VAF接近,4个样品两两比较,均呈高度相关(R2均≥0.990,P均＜0.001).结论 经NGS检测,工艺变更对水痘减毒活疫苗质量无影响.

目的 比较不同信号肽对SARS-CoV-2 S1、受体结合域(receptor binding domain,RBD)、RBD二聚体蛋白在Expisf9昆虫细胞中分泌表达的影响.方法 选取SARS-CoV-2 S1(M1-E661)、RBD(R319-P545)、RBD二聚体(R319-K537串联)3种蛋白的基因序列,按照N-端信号肽序列不同[内源(Endo)、蜂素honeybee melittin(HBM)、GP64、GP67、几丁质酶chitinase(Chi)、HIV-ENV]和C-端标签序列的不同,分为25组.通过Bac-to-Bac系统构建25种重组杆状病毒,建立25组三级毒种库.将B2和C4病毒分别接种至对数生长前期细胞(2.8×106个/mL)和对数生长中期细胞(1.2× 107个/mL).将各组病毒培养至100mL(500mL摇瓶),进行蛋白表达,并取样进行SDS-PAGE、Western blot和ELISA检测.S1、RBD、RBD二聚体蛋白各选择表达量较高的2组,进行重复验证.结果 B2、C4病毒接种至高密度细胞,分泌表达量未提高,接毒后培养4和5 d的分泌表达量存在显著差异.A7(Endo-S1-tag)的分泌表达量明显低于 A9(HIV-ENV-S1-tag),A4(Gp67-S1-tag)分泌表达量最高,A1(Endo-Endo-S1-tag)分泌表达量显著低于 A7(Endo-S1-tag);B6(HIV-ENV-RBD-tag)分泌表达量显著高于 B4(Gp67-RBD-tag)及其他信号肽组;C4(Gp67-RBD-dimer-tag)分泌表达量明显高于C3(Gp64-RBD-dimer-tag).分别选择每种蛋白表达量较高的2组(A4、A9;B4、B6;C3、C4)进行重复验证确定,结果显示,A4、B6、C4的分泌表达量最高.结论 S1、RBD二聚体蛋白分泌表达量最高的信号肽相同,是GP67信号肽,而RBD蛋白的最适信号肽是HIV-ENV信号肽.表明N-端序列会影响蛋白的分泌,信号肽序列有一定的通用性,但也与要表达的目的蛋白序列有关.

目的 制备水痘-带状疱疹病毒(varicella-herpes zoster virus,VZV)高效价特异性免疫血清,用于水痘减毒活疫苗及带状疱疹减毒活疫苗质量控制.方法 将高纯度重组gE糖蛋白分别与弗氏佐剂、氢氧化铝佐剂及MF59佐剂组合,免疫雄性家兔,每组2只,免疫后第56天,每只最大量采血(心脏或颈动脉)制备血清,与VZV混合进行中和反应后,接种至长满单层MRC-5株人二倍体细胞的6孔板中,孵育7 d,计数空斑数,检测免疫血清的中和效价和中和病毒能力;选择高中和效价和高中和病毒能力血清进行水痘减毒活疫苗及带状庖疹减毒活疫苗VZV(Oka株)工作种子批毒种鉴别试验和外源病毒因子检查.结果 重组gE糖蛋白的多种组合免疫家兔后制备的免疫血清均具有中和活性,其中重组gE糖蛋白与弗氏佐剂组合免疫后制备的血清中和效价最高,为1∶512,中和病毒能力可达240 000 PFU/mL;制备的免疫血清用于VZV(Oka株)工作种子批毒种鉴别试验和外源病毒因子检查,结果均符合要求.结论 重组gE糖蛋白可用于VZV高效价中和抗体制备,制备的高效价中和抗体适用于水痘减毒活疫苗及带状疱疹减毒活疫苗质量控制.

目的 改进水痘-带状疱疹减毒活疫苗毒种(OKa株)培养方法,提高毒种的均一性及稳定性,延长保存时间.方法 分别采用原培养方式(2L方瓶培养法)和改进的培养方式(40层细胞工厂)制备水痘-带状疱疹病毒OKa株工作种子批,检测病毒滴度及-65℃以下保存1、3、6、12个月的稳定性,并用该种子批分别制备3批水痘减毒活疫苗后,进行疫苗成品的全面检定.结果 2L方瓶培养法和40层细胞工厂制备的水痘-带状疱疹病毒工作种子批OKa-2015[1]C和OKa-2015[2]C的病毒滴度分别为6.1和6.0 lgPFU/ml;无菌试验、支原体检查、鉴别试验、外源因子检查结果均符合《中国药典》三部(2015版)相关要求;-65℃以下保存12个月,滴度均无明显下降.两种培养方式各制备的3批疫苗成品的各项检定结果均符合《中国药典》三部(2015版)相关要求,各批疫苗的病毒滴度及37 ℃热稳定性差别不明显.结论 40层细胞工厂制备水痘-带状疱疹病毒毒种(OKa株),-65℃以下长期保存具有稳定性,该培养方式可提高毒种的均一性,降低微生物污染风险.

目的 研究甲肝病毒YN5D株在人二倍体细胞Walvax-2(W2)上的传代适应性,并确定其在W2细胞上培养的最适条件.方法 将甲肝病毒YN5株P23代采用混合吸附的方式接种于T225细胞培养瓶,连续传至30代,检测各代次YN5D株病毒的抗原滴度及感染性滴度;将甲肝病毒YN5D株P29代以不同的MOI接种W2细胞,以最佳MOI接种细胞,确定最佳收毒时间;建立甲肝病毒YN5D株三级种子库,并进行检定.结果 甲肝病毒YN5株连续传至30代,抗原滴度及感染性滴度均保持在10 240 EU/mL和7.00 lgCCID50、mL以上;当接毒比例为0.5 MOI时,抗原滴度及感染性滴度均达到最高;当培养至24～28 d时,抗原滴度及感染性滴度均达到最高,分别为2 560 EU、mL和7.24 lgCCID50/mL.三级毒种库各项检定结果均符合《中国药典》三部(2015版)要求.结论 确定了甲肝病毒YN5D株在人二倍体细胞系W2上的传代适应性,并优化了细胞工厂的培养条件,为人二倍体甲肝疫苗临床申报样品的制备工艺奠定了基础.