为解析汾酒厂区酵母菌资源的多样性,采用分离培养方法,从汾酒酿造车间和车间外环境中的微生物中分离纯化到300株酵母菌,经26S rDNA序列比对分析,检测到酵母菌包括6科15属21种.系统发育树结果表明,汾酒酿造车间和车间外环境中的酵母菌包括担子菌门(Basidiomycota)和子囊菌门(Ascomycota)两个分支.尽管汾酒酿造车间和车间外环境中各有特异的酵母菌,但是两者都存在与白酒酿造相关的酵母菌如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)和扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)等.汾酒环境中含有丰富的酵母菌资源,可能是大曲和酒醅发酵过程中酵母菌的主要来源.这些都为进一步研究指明了方向.

[背景]宁夏贺兰山东麓是中国生态最佳、酿酒葡萄质量最优产区之一,也是中国"葡萄酒地理标志产品"保护区域之一.[目的]筛选宁夏本土优良酵母菌株,比较分析各个酿酒酵母菌株对赤霞珠葡萄酒香气质量的影响,并结合感官评价筛选对葡萄酒风味影响较大的酿酒酵母菌株.[方法]将筛选出的 11 株起酵速度快,而且对高浓度酒精、SO2 和葡萄糖及低酸环境有较强耐受力的酵母菌株进行 26S rDNA 鉴定,确定酵母种类.不同酿酒酵母发酵的赤霞珠葡萄酒通过顶空固相微萃取和气相色谱-质谱联用技术测定其香气化合物.[结果]筛选出 11 株可在 15%酒精度、500 g/L葡萄糖、350 mg/L SO2 和pH 3.0 环境下生长的酵母菌株,对其进行 26S rDNA鉴定,确定10 株酵母菌株H5、G9、G3、X8、G14、L10、H3、X11、Z17、Z24 为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),一株酵母菌L1 为发酵毕赤酵母(Pichia fermentans).测定的所有香气化合物中,酯类物质是赤霞珠葡萄酒香气物质的主要组分,其次是醇类.其中,乙酸乙酯、乙酸异戊酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、1-辛烯-3-醇和β-大马士酮等的香气活性值较高,对赤霞珠葡萄酒的香气贡献最大,赋予葡萄酒苹果味、香蕉味、蘑菇味、茴香味、甜味等令人愉快的气味.对不同酿酒酵母赤霞珠葡萄酒样香气物质进行聚类分析发现,酒样 G14 和 H3 与商业酵母 XR 最为接近,在对赤霞珠葡萄酒特征香气影响方面较一致.[结论]酿酒酵母G14 和H3 具有良好的酿酒潜力,可以作为本土优良酵母用于葡萄酒发酵,为提高宁夏地区葡萄酒质量奠定基础.

目的:克隆一种季也蒙毕赤酵母菌的尿酸酶蛋白编码基因,并通过重组表达和表征进行确认.方法:测定酵母细胞株C.G.M.C.C 2.1008的rRNA序列鉴定其所属种,串联质谱分析此天然尿酸酶肽段序列搜索同源蛋白,测定转录组验证其诱导表达属性,据季也蒙毕赤酵母ATCC 6260基因组信息推断所得尿酸酶(Uniprot id:A5DFP1)的编码序列设计引物,从C.G.M.C.C 2.1008细胞株cDNA中PCR扩增尿酸酶基因,测序后再克隆至定向表达载体pDE1及pDE2中构建带6His标签的重组表达质粒pDE1-MGU和pDE2-MGU,同时构建无6His标签的表达质粒R-MGU.在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达此真菌尿酸酶,SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS测定肽段分子质量,以尿酸为底物测定其动力学参数及抑制剂敏感性等性质,并与天然尿酸酶进行比较.结果:rRNA序列表明此菌株为季也蒙毕赤酵母,串联质谱分析胰蛋白酶解肽段表明此天然真菌尿酸酶与尿酸酶A5 DFP1高度相似,转录组测序支持此尿酸酶基因高效诱导表达.用所设计引物经PCR从cDNA快速获得编码序列,T载体测序显示其与A5 DFP1编码序列仅在第435位碱基不同但氨基酸仍相同.SDS-PAGE发现重组R-MGU肽段约35kDa;MALDI-TOF-MS发现其肽段约17.43kDa且与天然酶一致,但按氨基酸序列计算分子质量仅为33.98kDa,表明其可能存在化学修饰.重组表达带6His标签尿酸酶纯化后比活性接近6.0U/mg;R-MGU米氏常数、代表抑制剂的抑制常数及分子质量与天然尿酸酶无差别,但R-MGU很难纯化,使其相同条件下的热稳定性比纯化天然酶略差.结论:成功克隆了一种季也蒙毕赤酵母菌的尿酸酶,并实现其活性形式的重组表达.

为研究登革病毒与蚊虫相互作用的分子机制,本研究对DENV-2的E蛋白基因进行了毕赤酵母分泌表达.首先,经RT-PCR方法克隆DENV-2的E蛋白基因,将克隆的基因与表达载体pPICZaB连接以构建表达重组子;并经酶切、PCR、测序筛选实验鉴定正确重组子.然后,重组子经氯化锂法转化毕赤酵母菌KM71H获得转化子;经抗生素、表型鉴定、PCR筛选得到Muts型的多拷贝转化子.最后,经甲醇诱导基因表达,Western-blotting方法鉴定蛋白表达情况及最佳表达时间.本研究对DENV-2的E蛋白成功进行了分泌表达,并且确定其表达最佳发酵时间为96 h;为进一步研究登革病毒与蚊虫相互作用的分子机制奠定了基础.

目的 评价应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)的假丝酵母菌鉴定的准确性.方法 应用分子方法包括PCR基因扩增和测序分析鉴定WC的假丝酵母菌,应用MALDI-TOF-MS鉴定分子方法确认的假丝酵母菌,建立白假丝酵母菌复合体鉴定数据库.结果 从VVC标本中应用分子方法鉴定出包括白假丝酵母菌、非洲假丝酵母菌、都柏林假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、C.bracarensis、C.nivariensis、季也蒙假丝酵母菌、葡萄牙假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、乳酒假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、C.metapsilosis、热带假丝酵母菌、奥默柯达菌、费比恩毕赤酵母菌、胶红酵母菌、酿酒酵母菌、阿萨希丝孢酵母等在内的假丝酵母菌324株,应用MALDI-TOF-MS能够正确鉴定株314株,正确鉴定率为96.91%,3株白假丝酵母菌、1株非洲假丝酵母菌、1株光滑假丝酵母菌、2株C.metapsilosis、1株季也蒙假丝酵母菌和1株酿酒酵母菌鉴定错误.1株Torulaspora pretoriensis未能鉴定.应用自建白假丝酵母菌复合体数据库可正确鉴定白假丝酵母菌153株(98.08%)、非洲假丝酵母菌37株(97.37%)和都柏林假丝酵母菌1株(100%),总正确鉴定率为97.95%(191/195).结论 MALDI-TOF-MS可用于快速和准确鉴定假丝酵母菌,对假丝酵母菌复合体的鉴定有优势.(中华检验医学杂志,2018,41:296-299)

为了获得表达量高、稳定性好及染料脱色效率高的细菌漆酶,通过PCR扩增出短小芽孢杆菌LC01的漆酶基因并构建重组表达载体pPICZαA-lac,转化毕赤酵母菌株SMD1168H后利用甲醇诱导培养重组菌获得重组漆酶,纯化并分析了重组漆酶的性质.重组菌株产漆酶活性在第7天达到最高,为1390 U/L.纯化的重组漆酶分子量为65 kD,以丁香醛连氮为底物的最适反应温度和pH分别为70℃和6.8.在pH 9.0放置10d活性没有下降,在70℃保温10h后仍保留36％的酶活.Al3+、Fe3+和Mn2+完全抑制漆酶活性.在介体乙酰丁香酮参与下该漆酶能够有效脱色RB亮蓝、活性黑5和靛红,在pH 9.0时6h的脱色率达到了90％以上,表明该重组漆酶能有效应用于染料废水的脱色处理.

目的:揭示百药煎传统炮制过程中的微生物菌群,同时初步考察所分离菌株鞣质水解能力.方法:应用经典微生物分离纯化方法,结合形态学考察和16S rDNA或18S rDNA基因序列分析,对百药煎炮制过程中样品进行微生物的分离及菌种初步分类鉴定.采用含单宁酸的固体培养基初步筛选具有鞣质降解能力的菌株.结果:共分离获得细菌7株、酵母菌7株、丝状真菌3株.7种细菌分别为枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、地衣形芽孢杆菌、黄海芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌菌株、同温层芽孢杆菌、其他芽孢杆菌;7种酵母菌分别为伯顿丝孢毕赤酵母、2株克鲁维酵母菌株、弗比恩酵母菌、奥默柯达菌、异常威克汉姆酵母菌、异常毕赤酵母菌;3株丝状真菌分别为青霉菌、卷枝毛霉菌、黑曲霉菌.除枯草芽孢杆菌、黄海芽孢杆菌、芽孢杆菌、克鲁维酵母菌HMY3、弗比恩酵母菌外,其余菌株均具有鞣质降解能力.结论:百药煎传统发酵炮制工艺涉及多种微生物共同参与混合发酵过程,初步筛选证明5株细菌、5株酵母菌和3株丝状真菌具有鞣质降解能力,这一发现为研究百药煎现代炮制工艺奠定了微生物菌种基础.

目的 调查四川大学华西医院抗生素相关性腹泻(antibiotic-associateddiarrhea, AAD)患者产毒艰难梭菌和白色念珠菌感染率,分析其临床特征并调查目前临床医师对AAD患者的治疗情况,为临床诊治提供参考依据.方法 收集2014年9月-2015年1月四川大学华西医院AAD患者大便标本.通过聚合酶链反应检测并鉴定产毒艰难梭菌和白色念珠菌,收集患者相关临床资料并进行分析.结果 126例AAD患者中检测出艰难梭菌28例,其中产毒艰难梭菌者20例(15.9％),A+B+型35.7％ (10/28),A-B +型35.7％ (10/28),A-B+型28.6％ (8/28).检出酵母菌者54例(42.9％),其中白色念珠菌20.6％ (26/126),光滑念珠菌8.7％ (11/126),热带念珠菌7.9％(10/126),近平滑念珠菌2.4％ (3/126),酿酒酵母1.6％ (2/126),奥默柯达酵母菌0.8％ (1/126),毕赤酵母菌0.8％ (1/126).其中2.4％ (3/126)同时检测出产毒艰难梭菌和白色念珠菌.AAD患者使用的抗菌药物主要是青霉素类、碳青酶烯类、第3代头孢菌素类、喹诺酮类,均伴有不同程度的基础疾病.AAD患者临床上主要使用益生菌和蒙脱石散治疗.结论 AAD患者白色念珠菌和产毒艰难梭菌感染率较高,影响因素复杂,需加强临床医师对AAD的诊治意识.

目的 探讨早产儿真菌性败血症的病原菌分布及危险因素.方法 选择2014年5月至2017年5月焦作市妇幼保健院收治的真菌性败血症早产儿35例为观察组,另选择非败血症早产儿55例为对照组;采集2组早产儿血样,进行真菌培养及鉴定;对2组早产儿的一般临床资料、实验室检查结果 、病原菌分布情况进行比较,并采用Lo-gistic多元回归分析早产儿真菌性败血症的危险因素.结果35例真菌性败血症早产儿的病原菌主要有近平滑假丝酵母菌、白假丝酵母菌、罗伦特隐球菌、无名假丝酵母菌、葡萄牙假丝酵母菌、粉状毕赤酵母菌、季也蒙假丝酵母菌,其中近平滑假丝酵母菌、白假丝酵母菌、罗伦特隐球菌、无名假丝酵母菌分别占42.86％(15/35)、17.14％(6/35)、14.29％(5/35)、11.43％(4/35).2组早产儿的性别、胎龄及体质量比较差异均无统计学意义(P>0.05);2组早产儿肺炎、肺透明膜病、坏死性小肠结肠炎及硬肿症发生率比较差异均无统计学意义(P>0.05);观察组早产儿住院时间长于对照组(P<0.05),观察组早产儿巨细胞病毒感染率、应激性溃疡发生率、发病前已达全胃肠道喂养率、经鼻持续气道正压通气率高于对照组(P<0.05);观察组早产儿氟康唑预防性应用率低于对照组(P<0.05).Logistic多元回归分析显示,发病前已达全胃肠道喂养、应激性溃疡及巨细胞病毒感染是早产儿真菌性败血症的危险因素(P<0.05).结论 早产儿真菌性败血症的病原菌以假丝酵母菌多见,其中近平滑假丝酵母菌比例最高.发病前已达全胃肠道喂养、应激性溃疡及巨细胞病毒感染是早产儿真菌性败血症的危险因素.

[目的]拟实现疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶TLL在毕赤酵母菌中的高效表达;初步探索该脂肪酶催化生物柴油的可行性及催化条件,为大规模工业生产生物柴油提供一种可行方案.[方法]比较分析α-信号肽和脂肪酶tll基因自身的信号肽对其分泌表达量的影响;构建脂肪酶tll基因多拷贝表达框,提高该基因在宿主基因组中的剂量,从而实现高效表达;直接以液体脂肪酶TLL为催化剂,采用单因子方法初步探索了其制备生物柴油的条件.[结果]α-信号肽融合和多拷贝均能提升TLL脂肪酶的表达水平.在14 L发酵罐中培养144 h后,发酵上清液的酶活可达到769 U/mL;液体脂肪酶TLL可成功地催化制备生物柴油,且获得88.3％的转酯率.[结论]该研究显著地提高了脂肪酶TLL的表达水平,初步确定了液体脂肪酶TLL可以直接制备生物柴油.