目的:探讨人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞氧糖剥夺/恢复(OGD/R)模型中应激诱导蛋白 Sestrin2基因过表达对线粒体分裂的调控作用及其机制。 方法:(1)将SH-SY5Y细胞分为正常对照组、OGD/R组、 Sestrin2过表达组及空载体组，后2组细胞预先采用慢病毒感染方法分别构建 Sestrin2过表达及空载体稳转细胞株，除正常对照组细胞外均给予氧糖剥夺4 h/恢复18 h造模处理。造模完成后采用细胞计数试剂-8(CCK-8)法检测各组细胞的存活率，采用Western blotting实验检测各组细胞中Sestrin2、线粒体动力相关蛋白1(Drp1)、线粒体分裂蛋白1(Fis1)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、胞浆Kelch样环氧氯丙胺相关蛋白1(Keap1)、胞核核因子E2相关因子2(Nrf2)的蛋白水平，采用透射电镜观察各组细胞中线粒体的超微结构，采用免疫荧光染色检测各组细胞中Nrf2的核移位情况。(2)将 Sestrin2过表达稳转SH-SY5Y细胞株分为 Sestrin2过表达组、鸦胆子苦醇+ Sestrin2过表达组、二甲基亚砜(DMSO)+ Sestrin2过表达组，后2组细胞在造模前分别给予Keap1/Nrf2通路抑制剂鸦胆子苦醇(终浓度100 nmol/L)或DMSO溶液(终体积分数0.1%)预处理4 h，然后各组细胞均给予氧糖剥夺4 h/恢复18 h造模处理。造模完成后采用Western blotting实验检测各组细胞中胞浆Keap1、胞核Nrf2、Drp1、Fis1的蛋白水平。 结果:(1)与OGD/R组相比， Sestrin2过表达组细胞的存活率明显升高（61.33%±1.15% vs. 81.00%±3.00%)，Bcl-2/Bax值明显升高（0.467±0.006 vs. 0.880±0.010)，Drp1、Fis1、胞浆Keap1蛋白水平明显降低（1.089±0.033 vs. 0.865±0.014；0.829±0.009 vs. 0.350±0.007；0.967±0.017 vs. 0.881±0.024)，胞核Nrf2蛋白水平明显升高(0.627±0.025 vs. 0.957±0.015)，差异均有统计学意义( P<0.05)；并且， Sestrin2过表达组细胞的线粒体结构明显较OGD/R组更完整，Nrf2发生了明显的核移位。(2)与 Sestrin2过表达组相比，鸦胆子苦醇+ Sestrin2过表达组细胞胞核Nrf2的蛋白水平明显降低(0.920±0.013 vs. 0.627±0.035)，Drp1、Fis1的蛋白水平明显升高（0.994±0.020 vs. 1.084±0.005；0.728±0.010 vs. 0.906±0.022)，差异均有统计学意义( P<0.05)。 结论:Sestrin2基因过表达可下调胞浆Keap1蛋白水平、促进Nrf2核移位而激活Keap1/Nrf2通路，从而抑制线粒体分裂，减少细胞凋亡，减轻SH-SY5Y细胞的OGD/R损伤。

目的:评价O型唾液酸糖蛋白内肽酶(OSGEP)在小鼠肝缺血再灌注损伤中的作用及其与氧化应激反应的关系。方法:实验Ⅰ　SPF级健康雄性C57BL/6小鼠24只，野生型12只和OSGEP敲减型12只，6～8周龄，体质量18～22 g，采用随机数字表法分为4组( n＝6)：野生型假手术组(Sham组)、野生型HIRI组(HIRI组)、敲减OSGEP＋假手术组(Sham＋KD组)和敲减OSGEP＋HIRI组(HIRI＋KD组)。阻断肝动脉与肝门静脉60 min恢复灌注的方法制备缺血再灌注损伤模型，Sham组和Sham＋KD组仅暴露血管，不进行夹闭；HIRI组和HIRI＋KD组夹闭60 min恢复灌注。于再灌注6 h后处死小鼠提取肝组织标本，HE染色后光学显微镜下观察病理学结果进行Suzuki评分，检测血清ALT和AST浓度，DCFH-DA荧光探针法检测ROS水平，比色法测定肝组织MDA和谷胱甘肽(GSH)含量，采用Western blot法检测OSGEP表达水平。实验Ⅱ　将生长良好的AML12细胞采用随机数字表法分为4组( n＝30)：对照组(C组)、氧糖剥夺/复糖复氧组(OGD/R组)、氧糖剥夺/复糖复氧组＋敲减OSGEP组(OGD/R＋KD组)和氧糖剥夺/复糖复氧＋敲减OSGEP阴性对照组(OGD/R＋NC组)。C组在正常条件下培养，OGD/R组氧糖剥夺6 h后复糖复氧24 h，OGD/R＋KD组先构建稳定转染OSGEP的AML12细胞，余同OGD/R组。采用CCK-8法检测细胞存活率，检测LDH释放量，DCFH-DA法检测ROS水平，比色法测定MDA和GSH含量。 结果:实验Ⅰ　与Sham组比较，HIRI组OSGEP表达下调，血清AST和ALT浓度、Suzuki评分、肝组织ROS水平和MDA含量升高，GSH含量降低( P<0.05)，Sham＋KD组各指标差异无统计学意义( P>0.05)；与HIRI组比较，HIRI＋KD组血清AST和ALT浓度、Suzuki评分、肝组织ROS水平和MDA含量升高，GSH含量降低( P<0.05)。实验Ⅱ　与C组比较，OGD/R组OSGEP表达下调，细胞存活率和GSH含量降低，LDH释放量、ROS水平和MDA含量升高( P<0.05)；与OGD/R组比较，OGD/R＋KD组细胞存活率和GSH含量降低，LDH释放量、ROS水平和MDA含量升高( P<0.05)，OGD/R＋NC组各指标差异无统计学意义( P>0.05)。 结论:OSGEP在小鼠肝缺血再灌注损伤中通过抑制氧化应激反应发挥内源性保护作用。

目的:探讨神经细胞黏附分子(neural cell adhesion molecule，NCAM)衍生肽P2对缺血性脑卒中大鼠神经功能损伤的修复作用及机制。方法:提取并培养原代皮质神经元，氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation，OGD)造模后采用CCK-8法观察不同浓度P2对OGD条件下皮质神经元活性的影响，Western blot检测凋亡相关蛋白及细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal regulated kinase 1/2，Erk1/2)的表达。选取清洁级雄性SD大鼠进行动物实验，采用大脑中动脉线栓法(middle cerebral artery occlusion，MCAO)建立大鼠脑卒中缺血/再灌注损伤动物模型，造模成功的大鼠按照随机数字表法分为假手术组、MCAO组和MCAO+P2组，每组12只。术后MCAO+P2组大鼠每日一次皮下注射1 mg/kg P2，持续至术后14 d，其余两组大鼠均皮下注射等体积0.9%氯化钠溶液。平衡木实验观察大鼠运动功能损伤及恢复情况。免疫荧光染色检测大鼠脑梗死灶周边的神经元凋亡比率，Western blot检测大鼠脑梗死灶周边脑组织内Erk1/2蛋白的表达。采用SPSS 22. 0进行统计分析，平衡木实验数据采用重复测量方差分析，其他实验数据以单因素方差分析进行检验。结果:与OGD组相比，0.5，1.0和2.0 μmol/L的P2均可以提高OGD条件下神经元细胞活性，其中1 μmol/L的P2效果最好(2.436±0.284，1.551±0.410， P<0.05)。Western blot结果显示，加入1 μmol/L P2后凋亡相关蛋白bax [(76.120±3.232)%，(88.965±5.208)%， P<0.05]、cleaved caspase-3[(76.736±4.306)%，(97.781±8.111)%， P<0.05]和cleaved caspase-9[(88.833±6.581)%，(104.962±4.788)%， P<0.05]表达均低于OGD组，bcl-2[(56.146±3.882)%，(43.170±6.945)%， P<0.05]以及磷酸化Erk1/2蛋白[(73.583±8.557)%，(55.219±4.615)%， P<0.05]表达均高于OGD组。与MCAO组相比，P2干预后第14天时大鼠瘫痪侧后肢的滑脱率低[(23.438±11.540)%，(41.733±13.631)%， P<0.05]，病灶周边神经元凋亡比率低[(13.144±6.485)%，(26. 699±6. 402)%， P<0.05]，大鼠梗死灶周边脑组织内磷酸化Erk1/2蛋白表达高[(74.062±7.458)%，(53. 327±7.093)%， P<0.05]。 结论:低浓度NCAM衍生肽P2可对OGD条件下的神经元以及缺血性脑卒中大鼠发挥神经保护作用，其作用机制可能与Erk信号通路的活化有关。

目的:探讨G1对原代神经元氧糖剥夺损伤后氧化应激指标的影响及核因子E2相关因子2（nuclear factor-E2-related factor 2, Nrf2）在其中的作用。方法:将培养7 d的C57BL/6胎鼠皮质原代神经元细胞按随机数字表法分为6组（每组6孔）：对照组（C组）、氧糖剥夺/复氧（oxygen glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R）组、溶剂组、G1组、G1+对照病毒组和G1+Nrf2慢病毒组。C组，不做任何处理；OGD/R组，OGD 2 h后恢复氧糖；溶剂组，OGD 2 h后在培养液中加入适量溶剂，继续培养22 h；G1组，行OGD/R模型，复氧复糖后的正常培养液中加入终浓度为5 μmol/L的G1，继续培养22 h；G1+对照病毒组，感染对照慢病毒的原代神经元细胞行OGD/R模型，其余处理同G1组；G1+Nrf2慢病毒组，感染了Nrf2 shRNA慢病毒的原代神经元细胞行OGD/R模型，其余处理同G1组。利用分光光度法检测乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）含量，应用细胞计数试剂盒（cell counting kit-8, CCK-8）法检测细胞活力，采用ELISA法检测活性氧（reactive oxygen species, ROS）、丙二醛（malonaldehyde, MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide, SOD）和总抗氧化能力（total antioxidant capacity, T-AOC）的含量，采用Western blot和免疫荧光法检测Nrf2的表达。结果:与C组比较，OGD/R组和溶剂组LDH、MDA和ROS含量升高，细胞活力、SOD和T-AOC含量降低，Nrf2总蛋白水平和核内蛋白水平均升高（ P<0.05）；与OGD/R组比较，G1组LDH、MDA和ROS含量降低，细胞活力、SOD和T-AOC含量升高，Nrf2总蛋白水平和核内蛋白水平升高（ P<0.05）。与G1组及G1+对照病毒组比较，G1+Nrf2慢病毒组细胞活力、SOD和T-AOC含量降低，LDH、ROS及MDA含量升高（ P<0.05）；G1组与G1+对照病毒组比较，各指标差异均无统计学意义（ P>0.05）。 结论:G1可以通过Nrf2通路增加抗氧化酶活性减轻原代神经元OGD/R损伤。

外泌体可以改善由缺氧缺血引起的神经细胞损伤,但星形胶质细胞来源的外泌体(astrocyte-derived exosomes,As-exo)与线粒体功能、线粒体相关内质网膜(mitochondrial associated ER mem-brane,MAM)的功能及线粒体自噬是否相关目前尚未明确.本研究旨在探究星形胶质细胞来源外泌体对氧糖剥夺再复氧(oxygen and glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)后 PC12 细胞线粒体功能、MAM以及线粒体自噬的调控作用.超速离心法提取星形胶质细胞培养基上清中的外泌体并对其进行鉴定.利用活细胞工作站观察到荧光标记后的外泌体在24 h时即在PC12细胞内出现明显的富集现象,同时在激光共聚焦扫描显微镜下观察到外泌体与线粒体出现共定位现象;采用Sea-horse 细胞能量代谢分仪检测线粒体压力变化:与Control组相比,OGD/R组的基础呼吸、质子漏、最大呼吸和ATP相关呼吸都有明显降低(P＜0.05或P＜0.01),OGD/R+exo组与OGD/R组相比4项指标都升高且差异具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);线粒体和内质网共定位结果表明,MAM受到氧糖剥夺再复氧伤害时,结构出现距离减小的聚合现象,而As-exo处理后MAM聚合现象减弱;流式结果表明,As-exo,一定程度恢复由氧糖剥夺损伤带来的线粒体膜电位降低和ROS升高;Western印迹结果显示,As-exo能显著抑制由OGD/R引起的线粒体自噬相关蛋白张力蛋白同源物诱导的假定激酶 1(PTEN induced kinase 1,PINK1)和 Parkin 蛋白(parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase,Parkin)升高,加入As-exo可降低LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ蛋白表达量,升高P62蛋白的表达水平,降低OGD/R引起的线粒体自噬水平.由此可见,OGD/R处理能引起PC12细胞的线粒体功能紊乱、MAM结构改变及线粒体自噬增加,As-exo处理后能改善细胞的线粒体功能、减弱MAM的形成和降低线粒体自噬,从而具有预防缺血性脑卒中再灌注损伤的治疗潜力.

目的:探讨神经营养因子3(NT-3)促进大鼠脑缺血再灌注损伤后神经功能恢复的作用及其机制.方法:将24只SD大鼠,随机分成假手术组(Sham)、大脑中动脉栓塞/再灌注(MCAO/R)组、MCAO/R+NT-3组.应用改良Garcia评分对各组大鼠进行神经功能评分.应用Western Blot检测各组脑组织中NT-3和LC3B表达.将新生大鼠皮质来源的神经元分成正常组(Normal)、糖氧剥夺(OGD)组、OGD+NT-3组、OGD+NT-3+PF-06273340(TrkC 抑制剂)组、OGD+NT-3+ZSTK474(P13K 抑制剂)组、OGD+NT-3+CCT128930(AKT 抑制剂)组.应用 Western Blot 检测神经元中 TrkC、p-PI3K、p-AKT 及 LC3B 的水平.观察 Normal 组、OGD 组、OGD+NT-3组中神经元形态变化并应用自噬体荧光染色剂染色,观察神经元自噬现象.结果:通过动物实验发现,NT-3在缺血再灌注损伤的脑组织中表达增多(P＜0.05),且应用外源性NT-3治疗后,改良Garcia评分升高(P＜0.05),自噬水平减弱(P＜0.05).通过细胞实验发现,NT-3能够抑制缺血缺氧状态下的神经元自噬并且最大限度的维持神经元形态.应用PF-06273340后p-PI3K、p-AKT表达减少(P＜0.05).应用ZSTK474、CCT128930后,NT-3抑制自噬的作用减弱(P＜0.05).结论:NT-3经PI3K/AKT信号通路抑制自噬以维持神经元存活,从而促进大鼠脑缺血再灌注损伤后神经功能恢复.

背景:牛磺熊去氧胆酸是一种亲水性胆汁酸衍生物,在多种神经系统疾病模型中均有神经保护作用,但目前鲜有报道研究牛磺熊去氧胆酸对脊髓损伤的作用.目的:观察缺糖缺氧条件下牛磺熊去氧胆酸对脊髓神经元凋亡的作用,以及对脊髓损伤后小鼠运动功能恢复的影响.方法:①体外实验:从孕13.5 d的C57 BL/6小鼠胚胎中分离提取原代脊髓神经元,培养72 h后,分3组处理:正常组加入Neurobasal完全培养基,置于CO2培养箱(体积分数5%CO2+95%空气)内培养24 h;氧糖剥夺组加入无糖的Neurobasal培养基,置于三气培养箱(体积分数94%N2+5%CO2+1%O2)培养12 h,更换为Neurobasal完全培养基后置于CO2培养箱内培养12 h;实验组处理过程大致同氧糖剥夺组,其中在加入无糖Neurobasal培养基的同时加入牛磺熊去氧胆酸.采用TUNEL染色检测细胞凋亡,CCK-8法检测细胞活性,免疫荧光染色检测细胞βⅢ微管蛋白表达.②动物实验:采用随机数字表法将60只C57 BL/6小鼠分为假手术组、脊髓损伤组与实验组,每组20只,脊髓损伤组与实验组采用Allen打击法建立T9-T10脊髓损伤模型,造模后第1天开始,实验组灌胃给予牛磺熊去氧胆酸溶液,假手术组与脊髓损伤组灌胃给予生理盐水,1次/d.连续给药14 d后,采用行为学和组织学方法评估脊髓组织修复情况.结果与结论:①体外实验:TUNEL染色、CCK-8与免疫荧光染色检测显示,氧糖剥夺组细胞凋亡数量高于正常组(P<0.01),细胞活性与βⅢ微管蛋白表达低于正常组(P<0.01);实验组细胞凋亡数量低于氧糖剥夺组(P<0.01),细胞活性与βⅢ微管蛋白表达高于氧糖剥夺组(P<0.01).②动物实验:旷场实验BBB评分与后肢足迹实验显示,实验组小鼠行走与运动功能恢复程度好于脊髓损伤组.苏木精-伊红染色显示,脊髓损伤组小鼠脊髓损伤部位可见明显畸形和空洞,神经细胞数量明显减少;与脊髓损伤组比较,实验组脊髓损伤病变面积显著减小,脊髓畸形程度更小、空洞更少,神经细胞数量增加.免疫荧光染色显示,脊髓损伤组神经元胞核标记神经元细胞数量少于假手术组(P<0.01),实验组神经元胞核标记神经元细胞数量高于脊髓损伤组(P<0.01).③结果表明:牛磺熊去氧胆酸能减少缺糖缺氧引起的脊髓神经元凋亡、轴突的丢失,促进脊髓损伤小鼠运动功能的恢复.

目的 研究人参皂苷Rg1对缺血性脑卒中后神经元铁死亡的抑制作用及其机制.方法 细胞水平建立HT22细胞氧糖剥夺/复氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)模型,CCK-8法检测Rg1对OGD/R损伤后HT22细胞活力的影响,试剂盒检测细胞铁死亡标志物GSH/GSSG、SOD、MDA和Fe2+含量的影响;Western blot检测细胞GPX4、xCT和Nrf2蛋白的变化;ML385干预Nrf2验证其在Rg1调节OGD/R引起的细胞铁死亡中的作用.动物水平建立大鼠短暂性大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注模型,分为假手术组、模型组、Rg1治疗组(40 mg·kg-1)和Fer-1铁死亡抑制剂组(0.2 mg·kg-1).缺血90 min后拔栓并给药,再灌注24 h后进行Zea Longa和Gar-cia Test评分评估神经受损程度;透射电镜观察皮质神经元线粒体形态变化;Western blot检测GPX4和xCT蛋白水平.结果 Rg1能明显提高OGD/R后HT22细胞存活率,上调GSH/GSSG比值,恢复SOD活性,降低MDA和Fe2+含量,并促进GPX4,xCT和Nrf2蛋白表达,而ML385干预明显抑制了Rg1对OGD/R后HT22细胞存活率及GPX4、xCT蛋白的上调作用.在体动物实验结果表明,Rg1可上调MCAO大鼠皮质组织GPX4和xCT的表达,缓解神经元线粒体的形态损伤,改善神经功能.结论 人参皂苷Rg1可通过促进Nrf2/xCT/GPX4通路抑制缺血性脑卒中神经元铁死亡.

目的 研究天麻蛋白对氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)诱导的HT22细胞损伤的保护作用及机制.方法 将体外HT22细胞常规培养,生长至对数生长期后铺板并随机分为对照组、OGD/R组、依达拉奉组、天麻蛋白组.以连二亚硫酸钠(Na2S2O4)10 mmol·L-1合并无糖DMEM培养基造成氧糖剥夺培养2 h,继而恢复为无血清高糖DMEM培养2 h进行复糖复氧处理,以建立体外OGD/R模型.依达拉奉和天麻蛋白为自氧糖剥夺前24 h开始即加入相应药物终浓度,持续至复糖复氧结束.采用MTT法检测细胞存活率,乳酸脱氢酶(LDH)法测定LDH泄露率,试剂盒测定超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性,丙二醛(MDA)含量及活性氧(ROS)水平,流式细胞技术Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡,Western blot检测OGD/R诱导损伤的HT22细胞内Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-3、p-AMPK、AMPK、Nrf2、Nrf2入核、HIF-1α、VEGF蛋白表达水平变化.结果 与对照组相比,OGD/R组细胞存活率下降(P<0.01),LDH泄露率升高(P<0.01),SOD、GSH-PX活性下降(P<0.01),MDA含量及ROS水平增加(P<0.01),细胞凋亡率增加(P<0.01),Bcl-2蛋白的表达量下降(P<0.01),Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表达量升高(P<0.01);与OGD/R组相比,天麻蛋白可提高细胞存活率(P<0.01),降低LDH泄露率(P<0.01),提高SOD活性及GSH-PX活性(P<0.01),降低MDA含量及ROS水平(P<0.01),降低细胞凋亡率(P<0.01),上调HT22细胞中Bcl-2、p-AMPK、Nrf2入核、HIF-1α、VEGF蛋白的表达量(P<0.01),有效抑制Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表达(P<0.01).结论 天麻蛋白对HT22细胞OGD/R损伤具有神经保护作用,其机制与活性氧/线粒体凋亡通路、AMPK-Nrf2通路和缺氧诱导因子通路相关蛋白密切相关.

线粒体自噬是细胞为维持正常生理过程,产生的一种利用选择性清除损伤线粒体的机制,且与心脑血管疾病密切相关.脑缺血再灌注损伤是缺血性脑卒中后,通过血管再通手段恢复血液供给,反而会进一步加重缺血所致的功能障碍和结构破坏的现象.研究表明,线粒体自噬参与脑缺血再灌注损伤的机制有以下几种:①PINK1和Parkin参与了脑缺血再灌注损伤的病理过程.氧糖剥夺/复氧可激活PINK1介导的线粒体自噬,在其病理生理过程中发挥重要作用.②脑缺血再灌注损伤的首发事件,是脑血流中断造成的脑组织缺血缺氧.BNIP3是低氧诱导因子1的靶基因,其启动子序列中含有低氧反应元件,低氧时能被低氧诱导因子1转录激活,促进BNIP3表达上调.③Beclin1是自噬的调节蛋白,脑缺血再灌注损伤后,Beclin1在大脑不同部位的表达水平随缺血进程的发展出现升高或降低的复杂变化.因此,脑缺血再灌注损伤中Beclin1水平的上调或许可以激活线粒体自噬.本文主要对线粒体自噬在脑缺血再灌注中的机制进行综述,以期未来线粒体自噬作为靶点治疗脑缺血再灌注损伤提供参考.