为开发防治刺参腐皮综合征的复方中药,从14种中药中筛选出对灿烂弧菌(Vibrio splendidus)有明显抑制作用的单味中药,并通过正交实验确定最佳抗菌复方FF-Z(诃子∶五倍子∶穿心莲∶川芎=15 g∶2 g∶10 g∶5 g).在饲料中分别添加10、20、30和40 g/kg的复方FF-Z作为试验组,不含复方FF-Z的饲料为对照组,并以含恩诺沙星粉20 g/kg的饲料为药物对照组,连续投喂刺参10d,继而用终浓度为107 CFU/mL的灿烂弧菌进行浸浴攻毒,以观察预防保护效果.结果显示,灿烂弧菌对复方FF-Z极敏感,抑菌圈直径可达(23.10±0.62)mm,最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)值分别为7.81和15.63 mg/mL;与阴性对照组相比,复方FF-Z各剂量组刺参的SOD、ACP和AKP活性显著提高,且优于药物对照组.在灿烂弧菌感染后,复方FF-Z各剂量组处理的刺参发病时间比阳性对照组推迟2d,其中复方FF-Z 20 g/kg组、FF-Z 30 g/kg组和FF-Z 40 g/kg组刺参的20d发病率分别为22.08％、22.14％和14.58％,显著低于阳性对照组的84.45％.组织病理学观察结果表明,添加30 g/kg复方FF-Z的饲料能够有效减轻灿烂弧菌入侵引起的刺参组织炎症反应,从而起到保护作用.研究证明,复方FF-Z能够显著提高刺参的免疫和抗病力,对灿烂弧菌引起的腐皮综合征具有良好的预防保护效果,能延缓该病的发病进程并降低发病率.

为了明确仿刺参(Apostichopus japonicus) IκB [Inhibitor of nuclear factor kappa-B (NF-κB)]激酶(IKK)基因的序列及分子进化信息,掌握仿刺参中该基因的组织表达规律及其对海参致病菌的响应规律.本研究利用转录组数据库挖掘和cDNA末端快速扩增(RACE)技术首次获得仿刺参IKKβ基因(命名为AjIKKβ)的全长cDNA序列.结果 表明,仿刺参AjIKKβ基因的cDNA全长为2 854bp,其中5'非编码区长度为159 bp,3'非编码区长度为331 bp,开放阅读框(ORE)长度为2 364 bp,共编码787个氨基酸.生物信息预测显示AjIKKβ蛋白的相对分子量为89.6 kD,理论等电点为6.83.同源性及系统进化分析结果显示,仿刺参与其它6种海洋生物IKKβ蛋白序列的相似性为51.37％,具有一定的保守性.实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测发现,AjIKKβ基因在仿刺参管足,体腔液,呼吸树,肠,体壁和纵肌6种组织中均有表达,其相对表达量从高到低依次为体腔液＞呼吸树＞管足＞肠＞纵肌＞体壁,且具有鲜明的组织特异性.利用灿烂弧菌(Vibrio splendidus)进行感染实验,发现,与未感染致病菌的对照组相比,致病菌感染组仿刺参体腔细胞中AjIKKβ的相对表达量在感染后的4h、8h、24 h、48 h和72 h均呈现显著的上调趋势(p＜0.05),提示AjIKKβ基因在仿刺参免疫防御中发挥重要作用.本研究结果不仅丰富了棘皮动物IKKβ基因的序列和结构信息,更为初步了解棘皮动物IKKβ基因的免疫调控功能提供基础数据.

为了初步明确仿刺参中Akt基因的序列信息、进化特点以及生物功能,本研究利用分子生物学手段获得了仿刺参Akt基因(AjAkt)的cDNA全长,并,对该基因的序列特征、组织表达规律以及对灿烂弧菌(Vibrio splendidus)刺激的响应规律进行了研究.结果 显示,AjAkt全长1 828 bp,其中,开放阅读框(open reading frame,ORF)的长度为1 434 bp,编码477个氨基酸,5'非翻译区(5'-UTR)和3'非翻译区(3'-UTR)的长度分别为188 bp和204 bp.预测的AjAkt蛋白的相对分子质量为55.47 kD,等电点(pI)为5.43.序列分析显示,AjAkt含有丝氨酸或苏氨酸蛋白激酶即蛋白激酶B家族的3个特征性结构域,轻度亲水且无跨膜结构及信号肽.同源性分析表明,AjAkt的氨基酸序列与蓝海燕(Asterina pectinifera)的Akt相似性最高(65.9％).基因相对表达分析结果显示,AjAkt在仿刺参呼吸树、肠、体壁、纵向肌肉、体腔细胞及管足中均有表达.其中,体腔细胞和肠中AjAkt的相对表达量显著高于其他4种组织(p＜0.05).灿烂弧菌感染实验发现,与对照组相比,AjAkt在成体仿刺参体腔细胞中的相对表达量在感染后的第4h至第72 h呈现极显著上调趋势(p＜0.01),其中两个相对表达高峰分别出现在感染后的第4h和第72h.本研究结果可进一步丰富棘皮类Akt基因的序列信息及进化数据,为深入研究该基因的生物学功能提供参考资料.

灿烂弧菌Vibrio splendidus作为一种水产条件致病菌,可以感染多种水产养殖动物,给水产养殖业带来巨大的经济损失.文中将核酸外切酶Ⅲ酶切信号放大策略和纳米金标记DNA探针核酸试纸条相结合,建立了一种新型高效的灿烂弧菌检测方法,检测结果可凭肉眼直接判定,并突破了常规免疫试纸条单克隆抗体制备困难的障碍.经过实验条件优化,该核酸试纸条对灿烂弧菌人工合成寡核苷酸DNA片段的检测限是5 ng/mL,对灿烂弧菌基因组DNA实际样本的检测限是10 ng/mL,较PCR法灵敏度高,并对灿烂弧菌具有检测特异性.研究结果实现了核酸试纸条的快捷制备及对灿烂弧菌的高效检测,为水产病害的防治开辟了新的途径.

基于环介导等温扩增(LAMP)技术建立水产品和养殖水域中灿烂弧菌现场可视化的快速、简便检测方法.以灿烂弧菌等作为研究对象,以灿烂弧菌的toxR基因作为靶基因,确定煮沸法为适合于弧菌基因组DNA提取的快捷方法,优化筛选的引物可以特异地检测灿烂弧菌,检测核酸浓度的灵敏度可以达到10-9g/L,并且结果稳定、可靠.采用该方法进行实际样品的检测应用,在558份水体样品和655份水产品样品中,灿烂弧菌阳性检出率分别为0.54％和0.46％,与实时荧光PCR方法的检测结果符合率为100％.低技术要求,低设备成本以及短检测时间使得可视化LAMP快检方法成为现场可使用的一个理想选择,这对于水产养殖业来说也更方便.