盖他病毒(Getah virus,GETV)是一种广泛分布于欧亚大陆及澳大利亚北部太平洋沿岸的人兽共患虫媒病毒,我国目前各地仅从蚊子中分离到该病毒.本研究在对一猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)流产胎儿进行多重RT-PCR检测时,由检测猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的一对引物扩增出一非特异性条带,测序及在NCBI数据库中BLAST结果显示,该序列与GETV序列高度相似.经病毒分离、传代、蚀斑纯化,获得一株能够在Marc-145细胞上稳定生长的分离物.电镜观察显示,该病毒有囊膜及纤突,直径约70 nm,接近于球形,具有披膜病毒科甲病毒属成员的典型形态特征,将该分离物命名为HNJZ-S1株盖塔病毒(Getah virus).全基因序列分析结果显示,分离物HNJZ-S1基因组全长11 689 bp,与GenBank中现有14株GETV序列相似性为97.4％～99.3％,其与韩国猪源毒株AY702913(登录号AY702913)序列相似性最高(99.3％).遗传进化分析显示,HNJZ-S1与日本蚊源毒株12IH26、马源毒株14-I-605-C1、14-I-605-C2及中国蚊源毒株HB0234亲缘关系最近,处于同一进化分支.其E2基因推导的氨基酸序列分析结果显示,HNJZ-S1与韩国猪源毒株AY702913和QIAG9302以及日本马源毒株14-I-605-C1、14-I-605-C2和中国蚊源毒株HB0234等处于同一进化分支.本研究首次从我国发病猪群中检测并分离到GETV,也是迄今为止中国唯一一株来自脊椎动物的盖他病毒,对猪源GETV的感染谱和致病性、感染和传播机制、环境微生物学及公共卫生等相关研究具有重要意义,并为之提供了宝贵的研究素材.

原核生物作为宿主细胞被广泛应用于异源蛋白质的重组表达,并且为生物活性蛋白质的制备提供了一种高效、经济的方法,因而在分子生物学中得到普遍的应用.然而,病毒蛋白在使用原核重组表达系统进行重组表达时,会出现病毒蛋白溶解性差和表达量低等问题.因此,通过使用各种融合标签以增加目的重组蛋白的表达量和溶解性成为有效的方法.本研究通过使用3种融合标签(EDA标签、MBP标签和GST标签)以获得表达量高的可溶性重组表达猪圆环病毒2型壳蛋白;并比较3种融合标签对该蛋白表达量、溶解性和稳定性的影响.研究结果表明,EDA标签可以显著提高重组表达的猪圆环病毒2型壳蛋白表达量,并且能够增强该蛋白的稳定性;MBP标签可增强重组表达的猪圆环病毒2型壳蛋白表达量,但是不能改善该蛋白的稳定性;GST标签能够增强该重组表达蛋白的表达量,但是不能增强该蛋白的溶解性和稳定性.本研究将EDA作为PCV2-CP蛋白的融合标签,显著提高PCV2-CP-EDA重组蛋白的表达量和增强该重组蛋白的稳定性,为病毒蛋白的可溶性重组表达提供了一种新的融合标签.

伯氏疟原虫、约氏疟原虫和夏氏疟原虫是3种常见的鼠疟原虫,在疟疾疫苗研究中具有重要地位.环子孢子蛋白(CSP)、裂殖子表面蛋白-1(MSP-1)和顶端膜抗原1(AMA1)等抗原是几种有效的鼠疟原虫疫苗候选分子,本文综述了鼠伤寒沙门氏菌、卡介苗、乳酸乳球菌、根癌农杆菌、酵母菌、腺病毒、杆状病毒、牛痘病毒、A型流感病毒、猪细小病毒、刚地弓形虫和豚鼠利什曼原虫等载体介导的鼠疟原虫CSP、MSP-1和AMA1疫苗的研制现状.

目的 探讨猪Sus scrofa domesticus白细胞介素2(IL-2)和融合白细胞介素4/6 (IL-4/6)基因的共表达对仔猪免疫应答的影响,为进一步研制新型免疫调节剂来加强仔猪抵御断奶后多系统衰竭综合征奠定基础.方法 将猪IL-2和IL-4/6融合基因的共表达重组质粒,用壳聚糖材料包裹制成纳米颗粒,记作VRIL-4/6-2-CS.将仔猪分为2组,分别肌肉注射VRIL-4/6-2-CS(实验组)和生理盐水(对照组),2组均同时接种猪圆环病毒2型(PCV-2)疫苗,在接种后的第0、7、14、28天采集血样并分析免疫变化.结果 实验组仔猪血清中的IgG2a抗体数量和血液中CD4+、CD8+T淋巴细胞数量均显著高于对照组(P＜0.05);同时,实验组仔猪的IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、TLRs(TLR-2,7)、STATs(STAT-1,2,3)基因表达水平也显著高于对照组(P＜0.05).尽管2组之间PCV-2特异性抗体的含量差异无统计学意义,但是实验组仔猪的生长速率显著高于对照组(P＜0.05).结论 VRIL-4/6-2-CS能促进仔猪对PCV-2疫苗的免疫应答,是一种安全有效的免疫佐剂.

目的 对比血管生成素-1(angiopoietin-1,ANG-1)和血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在猪慢性心肌缺血模型中的促血管再生效果.方法 利用Ameroid血管压缩环建立26只猪慢性心肌缺血研究模型,4周后分成3组:腺病毒携带ANG-1组(AdANG-1,n=9),腺病毒携带VEGF组完全恢复灌注术后4周仍然保持缺血状态(AdVEGF,n=10)和空载体对照组(n=7).分别在腺病毒介导的基因移植4和12周后,利用荧光微球法测定缺血心肌的局部血流量,并同时进行免疫组化检测.结果 基因移植后4周,AdANG-1组左心室心肌缺血区的灌注量[(3.25±0.16) mL·min-1·g-1]明显高于AdVEGF组[(1.09±0.13)mL·min-1·g-1]和对照组[(1.20±0.03) mL·min-1·g-1] (P＜0.05).基因移植后12周,AdANG-1组和AdVEGF组的左心室缺血区心肌微血管密度分别为(19.61±1.76)/0.572 mm2心肌组织和(18.17±1.43)/0.572 mm2心肌组织,均明显高于对照组的(13.53±0.92)/0.572mm2心肌组织(P＜0.05).但就直径50～100μm小动脉密度而言,AdANG-1组较空载体对照组显著增加[(1.9±0.4)/0.572mm2心肌组织切面vs.(0.7±0.2)/0.572mm2心肌组织切面,P＜0.05],而VEGF组与空载体对照组相较则无明显差异.AdANG-1组增加了心肌微血管的密度进而提高了局部心肌灌注.结论 VEGF和ANG-1基因转移均可促进血管再生,但只有ANG-1可以促进功能性小血管的再生,从而稳定有效地增加了心肌灌注,并为心功能的改善提供了必要的组织解剖学基础.

目的 建立人用疫苗及生产用细胞中猪圆环病毒1型(porcine circovirus 1,PCV1)和2型(PCV2)PCR检测方法,并进行验证.方法 参照GenBank中登录的PCV1(KC447455)和PCV2(AY578327)序列,全基因组合成PCV1和PCV2基因序列,以合成的PCV1和PCV2全基因组序列DNA为模板,进行PCR扩增,对PCR反应中的退火温度进行优化.对优化后的PCR方法进行灵敏度和特异性验证,并用该方法检测疫苗生产用细胞KMB17、Vero工作种子批、脊髓灰质炎减毒活疫苗(oral poliomyelitis vaccine,OPV)收获液、冻干甲型肝炎减毒活疫苗(freeze-dried hepatitis A vaccine,fHAV)成品、肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)灭活疫苗收获液及成品、Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(inactivated poliomyelitis vaccine prepared with Sabin strain,SIPV)收获液及成品的PCV1和PCV2.结果 优化后的退火温度为63℃,建立的PCR方法最低可检测出10-1 fg/μL的目的基因,仅对PCV基因组DNA能扩增出特异性条带.用该方法检测生产用细胞KMB17及Vero工作种子批、OPV收获液、fHAV成品、EV71灭活疫苗收获液及成品、SIPV收获液及成品,均未检出PCV1和PCV2.结论 成功建立了生产用细胞种子、疫苗收获液及成品中PCV的PCR检测方法,该方法具有较高的灵敏度和较强的特异性,能够用于本所生物制品生产用细胞种子、疫苗收获液及成品中PCV污染的检测,从而提高生物制品的安全性.

目的 探讨基于宏基因二代测序技术检测呼吸道病毒的临床应用价值.方法 采用随机扩增法、脱氧核糖核酸纳米球、华大基因公司BGI-500测序平台及BWA算法为基础的比对法等技术进行呼吸道痰液标本病毒核酸提取物的二代测序分析,以痰标本中病毒序列数＞100为入选标准,分析检出病毒的类型、序列数及丰度值等参数.结果 根据入选标准,共收集到9例患者,其中77.78％(7/9)的患者合并存在免疫受损因素,如心外科术后、激素治疗、恶性肿瘤、HIV感染等,分别检测出不同病毒的核酸阳性结果如下:4例爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、2例单纯疱疹病毒1型(HSV1)、1例巨细胞病毒(CMV)、1例人博卡病毒、1例腺病毒D型,另外,部分标本中合并检出细环病毒、猪内源性病毒E.Pearson相关性分析表明,在各项测序参数中,RPKM参数(每100万个序列每100 bp碱基对,匹配上的序列数)与患者氧分压指标存在线性相关.结论 呼吸道病毒感染多发生在合并免疫抑制因素的宿主,检出病毒类型包括EBV病毒、HSV1病毒、CMV病毒等,且部分患者可同时检出细环病毒、猪内源性病毒E.另外,RPKM可能与肺部病变严重程度有关,提示RPKM可能对于预测肺内病灶严重程度有一定意义.

目的 建立人用疫苗生产用细胞、胰酶及疫苗成品中猪细环病毒(Torque teno sus virus,TTSuV)的PCR检测方法,并进行验证.方法 根据GenBank中登录的TTSuV1 (JN688927)及TTSuV2 (AY823991)的序列,合成TTSuV1及TTSuV2基因组部分DNA序列,连接于PUC57质粒上,制备重组质粒,以重组阳性质粒DNA为模板,PCR扩增316 bp的TTSuV1片段及252 bp的TTSuV2片段,同时验证方法的灵敏度和特异性.并采用该方法对2批0.1％胰酶、Vero、KMB17、MRC5、Hep2、BT细胞及6批疫苗[3批Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(inactivated poliomyelitis vaccine made from Sabin strain,SIPV)收获液、1批SIPV成品、1批冻干甲型肝炎减毒活疫苗[hepatitis A(live) vaccine,freezedried,fHAV]成品、1批肠道病毒71型(enterovivus type 71,EV71)灭活疫苗成品]进行检测.结果 建立的PCR法最低分别可检出10 fg/μL TTSuV1和0.01 fg/μL TTSuV2的目的基因;该方法可特异性扩增出TTSuV1和TTSuV2的目的基因条带.2批0.1％胰酶、Vero、KMB17、MRC5、Hep2、BT细胞及6批疫苗均未检出TTSuV1及TTSuV2.结论 成功建立了疫苗生产用原材料、细胞、疫苗收获液及成品中TTSuV的PCR检测方法,且该方法具有较高的灵敏度和特异性,可用于本所疫苗生产中对TTSuV的检测.

目的 对猪圆环病毒 (Porcine circovirus, PCV) Cap蛋白的主要B细胞抗原表位进行分析, 构建Cap表达多表位的原核表达系统, 并对表达的目的蛋白进行分析, 为猪圆环病毒诊断试剂开发奠定基础.方法 设计并合成PCV2Cap基因, 与PET-28a (+) 载体连接后并转入大肠杆菌BL21 (DE3) 中构建重组质粒PET-28 (a) -Cap, 对重组质粒进行诱导表达获得重组蛋白, 通过His亲和层析柱对重组蛋白进行纯化.结果 重组质粒在大肠杆菌中成功表达, 蛋白质分子量约为17.4 k Da, 与预期相符;Western blot结果显示, 重组蛋白可以与猪圆环病毒阳性血清发生特异性结合.结论 PCV2 Cap蛋白的表达纯化为圆环病毒血清抗体诊断方法的建立, 进而为养殖场有效监控猪圆环病毒的免疫保护情况奠定基础.

该研究对山东省某猪场疑似患有断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的病猪进行了临床病理学检测和病理组织切片观察.PCR检测阳性的病料处理后接种PK-15细胞,通过连续传代培养分离到一株猪圆环2型病毒(porcine circovirus type 2,PCV2)(SDWF20107),并对其进行ORF2基因扩增、遗传进化分析以及氨基酸突变位点分析.序列分析表明,该毒株与其他参考毒株的核苷酸相似性介于77.2％～99.6％之间,氨基酸相似性介于82.1％～99.6％之间;分离株与2.1d亚型的毒株位于同一分支,表明分离毒株属于2.1d亚型.根据流行毒株的特征,该猪场改用高效圆环2型病毒疫苗并调整了免疫程序,使该猪场患病猪群症状很快消失,恢复正常生产水平.该研究结果为猪场中PCV2的基因分型及其变异情况提供了参考资料,也为今后PMWS的流行病学研究和防控提供理论依据.