目的 基于环磷酸腺苷/蛋白激酶A/环磷酸腺苷反应成分结合蛋白(cAMP/PKA/CREB)信号通路探讨柴胡皂苷(SS)对多发性抽动症(TS)模型小鼠的治疗作用.方法 将小鼠随机分为对照组、TS组、SS低剂量(SS-L)组、SS高剂量(SS-H)组、阳性药物组、SS-H+PKA抑制剂(H-89)组,每组10只.除对照组外,其他各组经腹腔注射亚氨基二丙腈溶液建立TS小鼠模型.造模后,SS-L组、SS-H组分别给予25、100 mg/kg SS腹腔注射,并以生理盐水灌胃;阳性药物组以0.5 mg/kg氟哌啶醇灌胃,并以生理盐水腹腔注射;SS-H+H-89组以100 mg/kg SS、5 mg/kg H-89腹腔注射,并以生理盐水灌胃;TS组及对照组分别以等体积的生理盐水腹腔注射、灌胃.每天1次,连续干预3周.对小鼠运动行为、刻板行为进行评分,用ELISA法检测纹状体组织中5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)以及多巴胺(DA),用苏木精-伊红法观察脑组织形态学变化,用免疫组化法检测黑质中酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元,用Western blotting法检测cAMP/PKA/CREB通路相关蛋白表达.结果 与对照组比较,TS组脑细胞形态被破坏,干预1、2、3周小鼠运动行为评分、刻板行为评分及纹状体组织中NE、DA水平、TH阳性神经元数量高(P均<0.05),纹状体组织中5-HT水平及cAMP、PKA、CREB蛋白表达低(P均<0.05);与TS组比较,SS-L组、SS-H组、阳性对照组脑细胞形态得到改善,干预1、2、3周小鼠运动行为评分、刻板行为评分及纹状体组织中NE、DA水平、TH阳性神经元数量低(P均<0.05),纹状体组织中5-HT水平及cAMP、PKA、CREB蛋白表达高(P均<0.05);S-H+H-89组逆转SS-H组各指标的变化(P均<0.05).结论 SS可能通过调节cAMP/PKA/CREB信号通路对TS小鼠发挥治疗作用.

目的 探索黄芪建中汤含药血清对异丙肾上腺素(ISO)诱导的3T3-L1脂肪细胞脂解及棕色化模型的抑制作用及与脑和肌肉芳烃受体核转录因子样蛋白-1(BMAL1)调控环磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)/环磷酸腺苷反应成分结合蛋白(CREB)信号通路的关系.方法 制备空白及黄芪建中汤含药血清.体外培养3T3-L1脂肪细胞,诱导其分化成熟后分为对照组、空白组、2.5％含药血清组、5％含药血清组、10％含药血清组.除对照组外,其余各组加入10 mmol/L ISO以构建脂肪细胞过度脂解及棕色化模型.采用油红O染色法和酶联免疫吸附剂测定(ELISA)法检测各组脂肪细胞内脂滴阳性面积比及其水解后产物的含量,采用实时荧光PCR法和蛋白质印迹法检测各组脂肪细胞脂解及棕色化相关基因及蛋白的表达,以筛选出最优体积分数的含药血清进行下一步慢病毒转染实验.取分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,分别加入BMAL1小干扰RNA、空载体小干扰RNA,构建沉默BMAL1的3T3-L1脂肪细胞.将细胞分为空载体组、含药血清空载体组、BMAL1沉默组和含药血清BMAL1沉默组.各组加入ISO孵育后,油红O染色法检测各组脂肪细胞内脂滴阳性面积比;ELISA法检测各组脂肪细胞内甘油三酯(TG)、cAMP及培养基中游离脂肪酸(FFA)的含量;蛋白质印迹法检测PKA、CREB的蛋白表达;实时荧光PCR法检测激素敏感性脂肪酶(HSL)、甘油三酯脂肪酶(ATGL)、线粒体解偶联蛋白1(UCP1)和T-box转录因子1(TBX1)的mRNA表达.结果 与2.5％及5％含药血清组比较,10％含药血清组细胞内cAMP含量及培养基中FFA含量降低(均P<0.05)、TG含量升高(P<0.05)、P KA蛋白表达降低(P<0.05)、HSL及ATGL mRNA表达降低(均P<0.05).慢病毒转染3T3-L1脂肪细胞后,与空载体组比较,BMAL1沉默组中BMAL1蛋白表达降低(P<0.05),表明BMAL1沉默的脂肪细胞成功构建.与空载体组比较,BMAL1沉默组细胞内脂滴阳性面积比及TG含量降低(均P<0.05),培养基中FFA含量、细胞内cAMP含量和PKA、CREB蛋白表达升高(均P<0.05),HSL、ATGL、UCP1和TBX1 mRNA表达量升高(均P<0.05).与BMAL1沉默组比较,含药血清BMAL1沉默组细胞内脂滴阳性面积比及TG含量升高(均P<0.05),培养基中FFA含量、细胞内cAMP含量、PKA和CREB蛋白表达降低(均P<0.05),HSL、ATGL、UCP1及TBX1的mRNA表达降低(均P<0.05).结论 黄芪建中汤含药血清可以抑制ISO诱导的3T3-L1脂肪细胞脂解及棕色化,其机制可能通过介导BMAL1调控cAMP/PKA/CREB信号通路有关.

目的:运用网络药理学方法构建青风藤的化学成分-疾病靶点-代谢信号通路网络,从而分析青风藤干预强直性脊柱炎(AS)的分子作用机制.方法:通过检索相关文献,并运用TCMSP数据库和SwissTargetPrediction数据库获取青风藤主要活性成分和作用靶点,利用DrugBank、GeneCards、TTD等数据库获取与AS相关的靶基因;整合药物与疾病的交集靶点,以String数据库对核心靶点构建蛋白互作网络(PPI)分析;最后通过DAVID数据库对核心靶点进行基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路分析,采用Cytoscape3.6.0构建青风藤活性成分-AS作用靶点-代谢信号通路的可视化网络.结果:通过筛选获得青风藤潜在活性成分共6个,得到可作用于AS的靶点37个,核心靶点涉及溶质载体家族6(神经递质转运蛋白),成员4(SLC6A4)、多巴胺受体D2(DRD2)、5-羟色胺受体3A(HTR3A)、前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、细胞色素P4502D6(CYP2D6)等.GO功能富集分析共得到150个条目(P<0.05),其中生物过程98个,细胞组成19个,分子功能条目33个.KEGG通路分析富集得到13条信号通路(P<0.05),主要包括神经活性配体-受体相互作用、钙信号通路、血清素激活突触通路、环磷酸腺苷(cAMP)信号通路、血管平滑肌收缩、环磷酸鸟苷-依赖性蛋白激酶(cGMP-PKG)信号通路等;分子对接研究证实青风藤中大多数活性成分与治疗AS的靶点有着较好的结合活性.结论:基于网络药理学的研究表明,青风藤中千金藤啶碱、青藤碱等成分是治疗AS的关键成分,这些成分可能调节PTGS2、SLC6A4等靶点,并作用于血清素激活突触、Janus激酶/信号转导与转录激活因子(JAK-STAT)等多条信号通路发挥发挥抑制炎症反应、调节免疫功能等作用来治疗AS,实现多成分、多靶点、多通路发挥对AS的治疗作用,具有一定的临床应用价值.

目的 利用网络药理学方法及分子对接技术探讨中医"药物金三角"的代表用药人参、丹参、葶苈子治疗慢性心力衰竭的潜在作用机制.方法 从公开数据库获取中医"药物金三角"的代表用药人参、丹参、葶苈子的活性成分并进行靶点预测,将其与心力衰竭致病基因相映射以获取作用靶点.随后对药物作用于心力衰竭的靶点进行富集分析,并对关键信号通路中的靶点与成分进行分子对接验证.结果 共获得药物潜在活性成分187个,对应靶点455个,作用于心力衰竭的靶点共97个,其中肿瘤坏死因子(TNF)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、信号转导和转录激活因子3(STAT3)、丝裂原激活的蛋白激酶8(MAPK8)、清蛋白(ALB)为关键靶点.经过富集分析,发现中医"药物金三角"治疗心力衰竭涉及对药物的反应、炎症应答、对外部刺激的反应等生物过程,可作用于环磷酸腺苷(cAMP)信号通路、环磷酸鸟苷(cGMP)-蛋白激酶G(PKG)信号通路、心肌收缩、心肌细胞中的肾上腺素能信号、醛固酮的合成和分泌等重要通路.分子对接结果显示,关键信号通路中的靶点与成分平均结合能为-29.246 kJ/mol,说明靶点与成分之间具有良好的对接关系.结论 中医"药物金三角"的代表用药人参、丹参、葶苈子可通过复杂网络形式调控心肌收缩、心脏负荷、心室重构等生理病理过程,从而发挥治疗心力衰竭的作用.

目的:基于网络药理学及分子对接技术分析远志治疗原发性失眠(PI)的作用机制.方法:通过Herb、Batman-TCM数据库筛选远志的化合物,用Swiss Target Prediction、SEA及Batman-TCM数据库行主要活性成分潜在靶点筛选,同时在Gene Cards、NCBI基因、TTD数据库筛选疾病相关靶点.将远志的主要活性成分靶点与疾病靶点输入Venny2.1行交集处理,筛选两者的共同靶点,运用Cytoscape3.8.0软件构建"药物-成分-疾病-靶点"PPI网络并行拓扑分析.使用RStudio4.0.3软件行基因本体(GO)功能富集与京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析,使用Discovery Studio软件将远志主要活性成分与疾病核心靶点进行分子对接.结果:筛选出远志中含有金丝桃苷、α-菠甾醇、芦丁、槲皮素等9种主要活性成分,261个药物潜在作用靶点,与2 600个PI相关疾病靶点取交集后获得87个共有靶点.拓扑分析筛选到白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)、人环磷酸腺苷反应元件结合蛋白1(CREB1)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、丝裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)等36个关键靶点.GO功能富集分析得到BP条目1 302项、MF相关条目101项、CC相关条目63项;KEGG通路富集分析筛选到神经活性配体-受体相互作用、γ-氨基丁酸(GABA)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶-B(PI3K-Akt)、环磷酸腺苷(cAMP)、TNF等79条信号通路;分子对接显示远志主要活性成分与疾病核心靶点亲和力均良好.结论:远志能够通过多成分、多靶点、多通路的协同作用影响机体的神经代谢、氧化应激及炎症反应,从而发挥治疗PI的作用.

目的:通过建立气阴两虚证小鼠模型,探讨铁皮枫斗颗粒的益气养阴功效与作用机制.方法:将60只雄性ICR小鼠随机分为空白组、模型组、玉屏风颗粒组、铁皮枫斗颗粒高、中、低剂量组,每组10只,连续给药30 d.实验采用单日限制饮食,双日负重力竭游泳运动,结合灌胃左甲状腺素钠片构建小鼠气阴两虚证模型.动态观察小鼠一般状态,测定小鼠体质量、脏器指数、四肢抓力和力竭游泳时间;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定小鼠血清环磷酸腺苷(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)、白细胞介素-6(IL-6)、补体成分3(C3)、皮质醇(CORT)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、三碘甲状腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)、促甲状腺激素(TSH)、雌二醇(E2)和睾酮(T)相关指标,采用实时聚合酶链反应(Real-time PCR)观察下丘脑组织中蛋白激酶A(PKA)和cAMP反应元件结合蛋白(CREB)、信使核糖核酸(mRNA)表达水平.结果:与模型组比较,各给药组均可改善小鼠的一般状态,实验第30天,铁皮枫斗颗粒高、中剂量组均可增加小鼠体质量(P<0.01).铁皮枫斗颗粒高剂量组可以增大小鼠胸腺指数、脾脏指数和四肢抓力,延长负重游泳力竭时间(P<0.05,P<0.01),降低血清cAMP、cAMP/cGMP、T3、E2、E2/T和IL-6水平(P<0.05,P<0.01),升高血清T、C3水平(P<0.01),降低下丘脑组织PKAmRNA表达水平(P<0.01).铁皮枫斗颗粒中剂量组可以升高血清中TSH水平(P<0.01),低剂量组可以降低下丘脑组织中CREBmRNA的表达水平(P<0.05).结论:铁皮枫斗颗粒可以改善气阴两虚证小鼠的一般状态,通过调节环核苷酸、内分泌和免疫系统这一网络机制,上调PKA/CREB信号通路,起到益气养阴的功效.

目的:基于"大肠主津"理论探讨环磷酸腺苷/蛋白激酶A/环磷酸腺苷反应成分结合蛋白(cAMP/PKA/CREB)信号通路在溃疡性结肠炎(UC)水液代谢及肠上皮通透性中的作用及芍药汤的干预机制.方法:将60只雄性SD大鼠分为空白组、模型组、美沙拉嗪组(0.42g·kg-1)、芍药汤低、中、高剂量组(11.1、22.2、44.4g·kg-1),每组10只.采用复合病因造模法建立UC湿热内蕴证大鼠模型,空白组和模型组分别给予生理盐水灌胃,美沙拉嗪组给予美沙拉嗪灌胃,芍药汤低、中、高剂量给予对应剂量的芍药汤灌胃,灌胃周期为14 d.观察各组大鼠腹泻评分及粪便含水率变化,采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血浆二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸含量,免疫组化法检测各组大鼠结肠组织中水通道蛋白(AQP)8、AQP4及肠黏膜通透性相关蛋白ZO-1、Occludin的蛋白表达水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测结肠组织中cAMP、PKA、CREB蛋白表达.结果:与空白组比较,模型组大鼠腹泻评分及粪便含水率显著增高(P＜0.01),血浆二胺氧化酶(DAO)、血浆D-乳酸含量显著增高(P＜0.01),结肠ZO-1、Occludin、AQP8、AQP4、cAMP、PKA、CREB蛋白表达水平显著降低(P＜0.01);与模型组比较,各给药组血浆二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸含量显著降低(P＜0.01),结肠ZO-1、Occludin、AQP8、AQP4、cAMP、PKA、CREB蛋白表达水平显著升高(P＜0.01).结论:芍药汤减轻UC腹泻的机制可能是通过激活cAMP/PKA/CREB信号通路,上调AQPs的表达,增强肠上皮间紧密连接,进而改善结肠水液代谢和肠黏膜通透性.