甲醇来源丰富、价格低廉,已成为生物制造行业极具吸引力的底物之一.构建微生物细胞工厂实现甲醇到增值化学品的生物转化,具有过程绿色、条件温和、产品体系多样等优势,不仅能拓展基于甲醇的产品链,还能缓解当前生物制造"与民争粮、与粮争地"的问题,是实现绿色生物制造的重要手段.因此,阐明不同天然甲基营养菌中涉及甲醇氧化、甲醛同化和异化途径对于后续基因工程改造工作至关重要,也更有利于构建新型非天然甲基营养菌.本文讨论了甲基营养菌中甲醇代谢途径的研究现状,并结合近年来天然和人工合成甲基营养菌在甲醇生物转化中的应用进展及面临的挑战.

近年来荧光蛋白成为基因工程中常用的遗传标记,详尽解读不同荧光蛋白基因在甲基营养菌中的表达可以鉴定最适的荧光报告基因.克隆了常用的绿色荧光蛋白eGFP、红色荧光蛋白mCherry、黄色荧光蛋白YFP以及其他来源的绿色荧光蛋白wGFP和红色荧光蛋白RFP共5种荧光基因,构建相应的表达载体并在甲基营养菌Methylobacterium extorquens AM1中进行表达.通过荧光成像观察和SDS-PAGE蛋白凝胶电泳进行荧光蛋白表达鉴定.通过细菌生长曲线、荧光总量和相对荧光强度的测定,进行荧光稳定性和表达强度的鉴定.结果 在转化子中均检测到目的荧光蛋白条带,但RFP荧光表达量痕量且未检测到荧光成像;稳定性最强和相时荧光强度最高的是YFP,是常用eGFP的1.6倍,mCherry的3.4倍.在M.extorquerns AM1中最适荧光蛋白为YFP.

目的:考察甲基营养菌J1-1甲醇脱氢酶启动子活性与吡咯喹啉醌(PQQ)产量的相关性.方法:通过定点突变甲醇脱氢酶P0771启动子,利用lacZ作为报告基因检测突变启动子的转录水平,筛选出活性下降的突变启动子在J1-1中替换天然启动子获得突变菌株,检测突变菌株甲醇脱氢酶表达、酶活以及菌体生长和PQQ产量.结果:定点突变了7个P0771启动子,利用lacZ作为报告基因筛选出2个启动活性较天然启动子下降的突变启动子P0771-1、P0771-5,替换J1-1中天然启动子获得的突变菌株甲醇脱氢酶酶活都低于J1-1,在增菌培养基中其PQQ的合成水平分别提高约9.76％、11.6％.结论:通过启动子突变,降低甲醇脱氢酶启动子活性可以提高J1-1的PQQ产量.

吡咯喹啉醌(PQQ)广泛存在于生物体内,具有促进机体生长、维护线粒体功能、促进神经生长因子合成和调节机体自由基水平等生理功能,在医药、食品和化妆品领域具有广阔的应用前景.为提高脱氮生丝微菌Hyphomicrobium denitrificans FJNU-6的PQQ生产性能,文中以高浓度甲醇为拮抗因子进行实验室适应性定向驯化,通过光谱法快速筛选体系,选育PQQ高产正突变株.6轮适应性驯化后,每轮驯化的正向突变率达到90％以上,产量提高1倍的突变株达到10％左右.最后,利用5L发酵罐对突变株FJNU-R8进行分批补料培养,相较于出发菌株,突变株在不同甲醇浓度下pqq和moxF基因簇的表达量较高且差异较小,甲醇消耗和生长速度较慢,PQQ产量达到1 087 mg/L (143 h),单位细胞产量提高了1.42倍,展现出良好的工业应用潜力.文中所述的适应性定向驯化结合快速筛选体系能简单、快速地获得高产PQQ的生丝微菌突变菌株,对其他甲基营养菌高产PQQ突变株的高通量筛选具有借鉴作用.

甲基营养菌M.sp.MB200是本实验室保存的一株可以利用甲醇为碳源的甲基营养菌,具有利用甲醇作为底物生产L-丝氨酸的能力.提高其耐底物浓度的能力,有利于L-丝氨酸的转化.以M.sp.MB200野生菌株作为出发菌株,通过三亲本结合进行同源单交换构建突变修复基因mutL插入突变菌株MB200mTB,该突变株无法修复菌体在繁殖传代过程中产生的各种随机突变,以甲醇为碳源进行环境压力筛选,具有甲醇耐受突变的菌株可以在甲醇浓度不断升高的环境中生长,而其余突变方向菌株在高甲醇环境下不能生长,进而筛选出甲醇耐受方向的突变株.对耐高浓度甲醇的菌株使用三亲本结合回补mutL基因,得到了7株可以在甲醇浓度为7%的基础培养基中生长性状优异的突变株.在含7%甲醇的基础培养基中,MB200mHB1号突变株较出发菌株M.sp.MB200甲醇耐受性提升近4倍,菌体生长量增加2.2倍.

甲醇作为一种来源广泛、价格低廉、还原度高的非粮原料有望成为下一代生物制造的关键原料.利用合成生物学技术构建能够高效利用甲醇的重组微生物以实现从甲醇到高值化学品的生物转化已成国内外研究热点,但由于甲醇代谢过程的特殊性及复杂性,目前人工设计的甲基营养菌还难以实现以甲醇为唯一碳源进行生长及产物合成.基于对天然甲基营养菌甲醇代谢过程的分析,从甲醇脱氢酶的筛选与改造、甲醛同化途径的重构与优化、甲醇到化学品的生物转化几个方面对合成型甲基营养菌的构建策略及面临的挑战进行总结与分析,以期为今后合成型甲基营养菌的人工设计和利用提供一定的借鉴.

[背景]由于甲基营养菌被发现的时间较短,而且可以生产吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone,PQQ)的甲基杆菌属细菌只有少数菌株的全基因组序列被公布,增加了该类细菌基因组学和生物代谢途径研究的难度.[目的]将本实验室筛选的PQQ生产菌经多种诱变方式处理,用于提高PQQ的发酵产量.对高产突变菌株进行全基因组解析,以探究甲基杆菌PQQ合成的分子机制,为后续分子育种提供序列背景信息.[方法]将野生型PQQ生产菌株进行紫外诱变、亚硝基胍诱变、甲基磺酸乙酯诱变、硫酸二乙酯诱变和紫外-氯化锂复合诱变.将突变菌株利用PromethION三代测序平台和MGISEQ-2000二代测序平台测序,然后进行组装和功能注释.组装得到的全基因组序列与模式菌株扭脱甲基杆菌AM1(Methylobacterium extorquens AM1)进行比较基因组学分析.[结果]经11轮诱变获得一株突变菌株NI91,其PQQ产量为19.49 mg/L,相较原始菌株提高44.91％.突变菌株NI91的基因组由一个5 409 262 bp的染色体组成,共编码4957个蛋白,与模式菌株M.extorquensAM1比较发现其PQQ合成过程中剪切加工相关的基因pqqF和pqqG缺失,但首次在甲基营养菌中发现与基因pqqF具有相似功能的基因pqqL,且基因pqqC/D的序列存在较大差异.[结论]为甲基营养类细菌甲基杆菌的功能基因组学研究及PQQ合成机理研究提供了基础数据支持,NI91与模式菌株M.extorquens AM1的比较基因组学分析为揭示PQQ合成的不同机理提供了分子基础.

甲醇和甲烷等一碳原料来源广泛,价格低廉,是生物制造的理想原料.甲醇脱氢酶(Methanol dehydrogenase,MDH)催化甲醇生成甲醛是一碳代谢的关键反应.目前已从天然甲基营养菌中发现了多种利用不同辅因子,具有不同酶学性质的MDH.其中,烟酰胺腺嘌呤双核苷酸(NAD)依赖型MDH被广泛应用于构建人工甲基营养菌.但是,NAD依赖型MDH的甲醇氧化活性较低,对甲醇的亲和力较差,导致甲醇氧化成为人工甲基营养菌代谢甲醇的限速步骤.为了提高甲醇氧化速率,进而提高人工甲基营养菌的甲醇利用效率,近年来大量研究集中于MDH的挖掘与改造研究.文中系统综述了不同类型MDH的发现、表征、改造以及在人工甲基营养菌中的应用进展,详细阐述了MDH的定向进化和多酶复合体的构建,并展望了通过细胞生长偶联的蛋白质进化和蛋白质理性设计获得高活性MDH的潜在策略.

以牛粪污水为研究对象,通过高通量测序技术研究三种微生物除臭菌剂在牛粪污水除臭过程中对细菌多样性的影响,并对部分菌群功能进行预测分析.对分别添加布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)CC1、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)Q3、苍白杆菌(Ochrobactrum)FSB进行除臭处理的牛粪污水细菌多样性及群落结构进行分析对比.结果表明:(1)分别添加甲基营养型芽孢杆菌Q3和苍白杆菌FSB的处理可使粪水的微生物群落丰富度和多样性先升后降,而添加布氏乳杆菌CC1的处理微生物群落丰富度和多样持续升高.(2)在属水平,不同处理的组间差异性较大,微生物的丰富度、多样性、相似性、优势菌群均有不同.与除臭和降解功能相关的脱硫微菌属(Desulfomicrobium)、纤维素分解菌属(Ruminiclostridium)、Prolixibacter菌属和Desulfomicrobium菌属在分别添加菌剂处理的F、C、Q组与对照组K,CK差异明显并随着发酵时间的变化而变化,其中随着处理时间的延长,纤维素分解菌属(Ruminiclostridium)的丰度增加明显,菌剂处理组增幅明显大于对照组,发酵15天时在处理Q中,其丰度由0增加到13.01％,F处理和C处理分别由0增加到4.33％,而对照组仅由0增加到1.69％;具有除NH3功能的菌属Prolixibacter的丰度在所有处理中发酵3天时丰度最大,15天时为0;与产NH3功能相关的菌属Paracoccus随着发酵进程逐渐降低,在15天时完全消失;产生H2S的菌属Desulfomicrobium也随着发酵进程逐渐降低,由对照的5.22％下降至3％以下,并且添加菌剂组下降幅度大于不加菌剂组;病原菌Pesudomonas和Acholeplasma的数量呈现先升高后降低的趋势,由0天的1.54％和2.8％降至15天的1.38％和1.87％.(3)在门水平含量最多的是变形菌门(Proteobacteria),接下来依次为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、互养菌门(Synergistetes)、热脱硫杆菌门(Spirochaetae)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和纤维杆菌门(Fibrobacteres).其中,变细菌门在K2处理中丰度最高,达43.6％,在C1处理中最低,为27.5％,并且在所有处理中表现出发酵15天的丰富度大于3天的变化趋势.厚壁菌门在处理F、Q、C中也表现出发酵15天的含量大于3天的变化趋势.拟杆菌门和放线菌门在所有处理中都表现出随着发酵时间的延长而含量降低的现象,并且所有处理的含量均低于空白对照;在Q和F处理中,与纤维素降解相关的纤维杆菌门的含量明显升高.(4)功能菌群总体变化趋势为:分别添加三种菌剂组中纤维素分解菌群、有机物降解菌群、固氮菌群、H2S/NH3去除菌群种类和丰度明显高于对照组,而H2S/NH3产生菌低于对照组,病原菌和土著菌株经过发酵后含量明显降低或消失.

[背景]甲基营养菌(Methylobacterium)是一类能够以单碳或非C-C键低碳化合物(如甲烷、甲醇、甲醛等)为底物生长,并可生产多种代谢产物如氨基酸、工业酶和辅助因子、多羟基烷酸酯(polyhydroxyalkanoates,PHA)、多糖和类胡萝卜素等的革兰氏阴性细菌.[目的]通过突变甲基营养菌MB200的mutS基因,在胁迫条件下定向诱导,以获得可以耐受高浓度甲醇和甲醛的生产菌株.[方法]利用三亲本结合构建mutS基因缺失的高突变菌株MB200sTB,逐步提升培养液中甲醇、甲醛的浓度进行定向诱导突变,对获得的高耐受性突变株进行回补,分析菌株的生长情况.[结果]构建了 mutS基因的缺失突变体MB200sTB,并且得到了高耐受甲醇和甲醛的菌株MB200sHBc和MB200sHBq.MB200sHBc与野生株MB200相比其甲醇耐受性得到了极显著的提高,甲醇耐受浓度从8 g/L提升到44 g/L,但生长量不受影响.MB200sHBq在以甲醛为0.45 g/L的碳源条件下,生长量相较于野生型MB200提高了 1.69倍.[结论]通过定向诱导缺失mutS基因的突变体,可获得具有生产应用潜力的高耐甲醇菌株.