目的:观察吡咯并喹啉醌(PQQ)在氧化应激条件下对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)线粒体功能和细胞存活的影响，并探讨其作用机制。方法:体外用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基(下称正常培养基)培养大鼠BMSC，选取对数生长期的第3～5代细胞进行实验。(1)取细胞，分为正常对照组、正常对照＋PQQ组、单纯过氧化氢组、过氧化氢＋PQQ组。正常对照组细胞用正常培养基培养24 h；正常对照＋PQQ组细胞用含终物质的量浓度为100 μmol/L PQQ的正常培养基培养24 h；单纯过氧化氢组细胞用含有终物质的量浓度为200 μmol/L过氧化氢的正常培养基培养24 h；过氧化氢＋PQQ组细胞用含有终物质的量浓度为100 μmol/L PQQ的正常培养基培养2 h后，加入终物质的量浓度为200 μmol/L的过氧化氢培养24 h。于倒置相差显微镜下观察各组细胞形态，采用细胞计数试剂盒8法检测细胞存活率。(2)取5个批次细胞，均分为正常对照组、单纯过氧化氢组、过氧化氢＋PQQ组，各组细胞处理同实验(1)中相应各组。培养24 h后，采用流式细胞术对1个批次细胞进行细胞凋亡检测，计算细胞凋亡率；采用JC-1线粒体膜电位检测试剂盒和倒置相差荧光显微镜对1个批次细胞分别进行线粒体膜电位检测和JC-1荧光染色观察；采用透射电镜观察1个批次细胞线粒体形态；采用过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性测定试剂盒对1个批次细胞分别进行CAT和SOD活性检测；采用蛋白质印迹法对1个批次细胞环磷酸腺苷活化交换蛋白1(Epac1)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、磷酸化AMPK、剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、caspase-3蛋白表达进行检测，计算AMPK磷酸化水平、剪切型caspase-3/caspase-3比值。除形态观察外，其余各指标每组样本数均为6。对数据行单因素方差分析、独立样本等方差 t检验。 结果:(1)培养24 h后，单纯过氧化氢组细胞出现空泡且数量较正常对照组减少，细胞存活率为(74.3±2.9)%，较正常对照组的100.0%明显降低( t＝6.39， P<0.01)；与单纯过氧化氢组比较，过氧化氢＋PQQ组细胞形态明显改善，细胞存活率明显升高至(116.9±4.2)%( t＝6.92， P<0.01)；正常对照＋PQQ组细胞存活率为(101.2±1.1)%，与正常对照组相近( t＝1.06， P>0.05)。(2)培养24 h后，与正常对照组的(13.6±1.0)%比较，单纯过氧化氢组细胞凋亡率明显增加[(37.1±2.0)%， t＝10.57， P<0.01]；与单纯过氧化氢组比较，过氧化氢＋PQQ组细胞凋亡率明显降低[(17.0±0.7)%， t＝9.49， P<0.01]。(3)培养24 h后，与正常对照组比较，单纯过氧化氢组细胞线粒体膜电位出现去极化，JC-1荧光染料主要以单体形式存在于细胞质中，发出绿色荧光，表现为膜电位明显降低( t＝4.18， P<0.01)；与单纯过氧化氢组比较，过氧化氢＋PQQ组细胞线粒体膜电位升高至正常水平( t＝4.43， P<0.01)，JC-1荧光染料顺着极化线粒体膜电位进入线粒体聚集，发出红色荧光。(4)培养24 h后，与正常对照组的规则形态比较，单纯过氧化氢组细胞线粒体结构紊乱，线粒体嵴消失，线粒体基质密度降低；与单纯过氧化氢组比较，过氧化氢＋PQQ组细胞线粒体结构规则完整，线粒体嵴清晰可见，线粒体基质密度增加。(5)培养24 h后，与正常对照组比较，单纯过氧化氢组细胞CAT活性明显升高( t＝4.54， P<0.05)，SOD活性明显降低( t＝3.93， P<0.05)；与单纯过氧化氢组比较，过氧化氢＋PQQ组细胞CAT活性明显上升( t＝8.65， P<0.01)，SOD活性无明显变化( t＝0.72， P>0.05)。(6)培养24 h后，与正常对照组比较，单纯过氧化氢组细胞Epac1蛋白表达明显降低( t＝4.67， P<0.01)，AMPK磷酸化水平、剪切型caspase-3/caspase-3比值明显升高( t＝7.88、3.62， P<0.01)；与单纯过氧化氢组比较，过氧化氢＋PQQ组细胞Epac1蛋白表达、AMPK磷酸化水平均明显升高( t＝4.34、16.37， P<0.01)，剪切型caspase-3/caspase-3比值明显降低( t＝3.17， P<0.05)。 结论:PQQ预处理能够改善氧化应激条件下大鼠BMSC的线粒体功能，降低细胞凋亡率，提高细胞存活率，且可能与Epac1蛋白表达上调、AMPK信号通路激活和剪切型caspase-3蛋白水平降低有关。

目的:研究吡咯喹啉醌对小鼠年龄相关皮肤衰老的作用及机制。方法:将昆明种小鼠SPF级喂养，分为3组，每组10只，年轻组用普通饮食喂养8个月，年老组用普通饮食喂养20个月构建小鼠自然衰老模型，吡咯喹啉醌组在每公斤普通饮食饲料中添加吡咯喹啉醌4 mg喂养20个月。喂养结束后，取各组小鼠背部皮肤组织，HE染色检测皮肤表皮和真皮厚度；Masson染色检测皮肤总胶原变化；免疫组化检测增殖蛋白Ki67表达变化；透射电镜检测皮肤自噬体变化；Western印迹检测自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62表达变化，各组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD- t检验。 结果:HE和Masson染色显示，年老组表皮厚度[（15.67 ± 0.36）μm]和真皮厚度[（87.95 ± 11.86）μm]以及总胶原阳性百分率[（22.12 ± 1.72）%]均显著低于年轻组[（29.37 ± 0.25）μm、（264.93 ± 10.34）μm、（45.03 ± 1.54）%，均 P<0.05]，而吡咯喹啉醌组表皮厚度[（25.53 ± 0.47）μm]和真皮厚度[（145.01 ± 9.71）μm]以及总胶原阳性百分率[（31.17 ± 1.20）%]较年老组增加（均 P<0.05）。免疫组化结果显示，年老组皮肤增殖蛋白Ki67阳性细胞表达率[（13.74 ± 3.06）%]低于年轻组[（29.07 ± 2.79）%， P<0.05]和吡咯喹啉醌组[（21.20 ± 1.47）%， P<0.05]。透射电镜观察显示，年老组与年轻组比较，皮肤自噬体数量增加（ P<0.05），吡咯喹啉醌组自噬体数量较年老组减少（ P<0.05）。Western印迹实验显示，与年轻组比较，年老组Beclin-1表达降低（ P<0.05），LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下降（ P<0.05），p62表达升高（ P<0.05）；而吡咯喹啉醌组与年老组比较，Beclin1表达升高（ P<0.05），LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加（ P<0.05），p62表达降低（ P<0.05）。 结论:吡咯喹啉醌能够延缓小鼠皮肤衰老，其机制可能与增加小鼠皮肤细胞增殖能力和促进皮肤自噬水平相关。

目的:通过Tn5转座诱变筛选食甲基杆菌J1-1吡咯喹啉醌(PQQ)生物合成相关基因.方法:构建食甲基杆菌J1-1 Tn5转座突变体库,筛选PQQ合成水平差异明显的突变株,利用质粒拯救法鉴定突变基因,通过基因敲除、回补及过表达进一步研究该基因与PQQ合成的关系.结果:构建了j1-1的Tn5转座突变体库,筛选得到一株PQQ合成水平显著下降的突变株,经鉴定Tn5插入位点为mpq0056基因,该突变株在以甲醇为惟一碳源的培养基中生长速度略慢;敲除J1-1中mpq0056基因后,PQQ的合成水平下降,与Tn5诱变结果一致;回补该基因后,PQQ产量恢复到野生菌水平.结论:mpq0056基因参与了PQQ的生物合成,该基因可能编码分支酸盐裂合酶,并在PQQ生物合成中起重要作用.

吡咯喹啉醌(PQQ)是一种细菌脱氢酶的辅酶,具有促进机体生长、调节机体自由基水平等功能,应用于食品、医药等领域.由于化学合成法成本较高,微生物发酵法生产PQQ受到关注.目前,发酵法生产PQQ产量较低,限制了其工业应用.然而,由于对PQQ菌株的合成与调控机制尚缺乏深入理解,以及对野生型菌株缺乏必要的基因工程改造手段,目前采用代谢工程强化PQQ合成菌株还缺乏相关基础.因此,本研究以扭脱甲基杆菌Methylobacterium extorquens I-F2为研究对象,整合常压室温等离子体诱变、流式细胞术分选和高通量筛选策略,对样品制备和流式分选过程进行优化,最终筛选出一株PQQ高产突变菌株1-C6,PQQ产量比出发菌株I-F2提高98.02％.本文所述的流式细胞术结合高通量筛选方法能简单、快速地获得高产突变菌株,相比于基因工程改造和传统筛选方法,具有提升效果明显且易于实施等优势.

目的:研究吡咯喹啉醌(PQQ)通过对全身辐射(TBI)诱导的C57BL/6J小鼠腮腺损伤的保护作用.方法:随机将30只8周龄雌性C57BL/6J小鼠分成3组(n=10):未治疗组;4 Gy TBI组;4 Gy TBI加正常饮食添加PQQ组.4周后,取腮腺组织进行病理学和生化指标的测定.结果:PQQ部分纠正了TBI诱导的腮腺损伤,主要通过多个方面发挥对受损腮腺的辐射保护作用,如促细胞增殖、抑制细胞凋亡和衰老、上调抗氧化能力、清除氧自由基、减少DNA损伤.结论:PQQ可能通过上调抗氧化能力、抑制氧化应激,参与DNA损伤修复作用,从而发挥对TBI诱导腮腺损伤的辐射保护作用.

目的:筛选新的吡咯喹啉醌(PQQ)产生菌株.方法:收集土壤样品富集培养,分离菌株,NBT染色法快速筛选PQQ产生菌,经Native-PAGE复筛,NBT-Gly法和分光光度法相结合测定菌株PQQ产量;选取产量最高的1株菌考察菌株生长条件,扩增16S rDNA并测序,Blast比对分析确定菌株分类位置.结果:从500余份土壤样品中筛选得到1株PQQ产生菌T28,PQQ产量达13.3 mg/L.该菌株16S rDNA序列与生丝微菌的同源性为96％,确定了T28的最适生长培养基配方.结论:从土壤中筛选到1株新的PQQ产生菌,命名为生丝微菌T28.

氧化应激与线粒体功能障碍是心血管疾病的两个重要发病机制,两者在发生过程中均伴随氧自由基堆积而造成氧化损伤.吡咯喹啉醌(PQQ)的独特优势在于不仅具有强的抗氧化作用,还具有水溶性和热稳定性,可在体内环境下快速进入组织和细胞,稳定、高效地清除细胞内氧自由基而避免氧化损伤.其能高效减少氧化应激造成的氧自由基堆积从而减弱心肌损伤,并具有修复线粒体功能障碍,改善心肌功能的作用.未来,应深入研究PQQ在心血管疾病中的作用,并协同中医用药经验开发出新的可运用于心血管疾病的药物.

目的:考察甲基营养菌J1-1甲醇脱氢酶启动子活性与吡咯喹啉醌(PQQ)产量的相关性.方法:通过定点突变甲醇脱氢酶P0771启动子,利用lacZ作为报告基因检测突变启动子的转录水平,筛选出活性下降的突变启动子在J1-1中替换天然启动子获得突变菌株,检测突变菌株甲醇脱氢酶表达、酶活以及菌体生长和PQQ产量.结果:定点突变了7个P0771启动子,利用lacZ作为报告基因筛选出2个启动活性较天然启动子下降的突变启动子P0771-1、P0771-5,替换J1-1中天然启动子获得的突变菌株甲醇脱氢酶酶活都低于J1-1,在增菌培养基中其PQQ的合成水平分别提高约9.76％、11.6％.结论:通过启动子突变,降低甲醇脱氢酶启动子活性可以提高J1-1的PQQ产量.

吡咯喹啉醌(PQQ)广泛存在于生物体内,具有促进机体生长、维护线粒体功能、促进神经生长因子合成和调节机体自由基水平等生理功能,在医药、食品和化妆品领域具有广阔的应用前景.为提高脱氮生丝微菌Hyphomicrobium denitrificans FJNU-6的PQQ生产性能,文中以高浓度甲醇为拮抗因子进行实验室适应性定向驯化,通过光谱法快速筛选体系,选育PQQ高产正突变株.6轮适应性驯化后,每轮驯化的正向突变率达到90％以上,产量提高1倍的突变株达到10％左右.最后,利用5L发酵罐对突变株FJNU-R8进行分批补料培养,相较于出发菌株,突变株在不同甲醇浓度下pqq和moxF基因簇的表达量较高且差异较小,甲醇消耗和生长速度较慢,PQQ产量达到1 087 mg/L (143 h),单位细胞产量提高了1.42倍,展现出良好的工业应用潜力.文中所述的适应性定向驯化结合快速筛选体系能简单、快速地获得高产PQQ的生丝微菌突变菌株,对其他甲基营养菌高产PQQ突变株的高通量筛选具有借鉴作用.

目的 探讨吡咯喹啉醌(PQQ)对舌鳞状细胞癌细胞CAL27上皮间质转化(EMT)的抑制作用及可能机制.方法 采用MTT法检测PQQ对CAL27细胞增殖作用的影响;Transwell和划痕实验检测PQQ对CAL27细胞侵袭及迁移能力的影响;电子荧光显微镜下检测PQQ对CAL27细胞内产生活性氧(ROS)水平的影响.分别采用PQQ、ROS清除剂N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)和核因子-κB(NF-κB)激动剂佛波醇酯(PMA)处理细胞,Western blot检测EMT相关蛋白(上皮钙黏蛋白、波形蛋白、锌指转录因子Snail)和NF-κB通路活化水平的变化.结果 PQQ作用CAL27细胞24 h后,随着PQQ浓度的增加,CAL27细胞增殖受抑制,24 h的半数抑制浓度为6.69μmol·L-1.2μmol·L-1 PQQ作用CAL27细胞24 h后,细胞的侵袭及迁移能力明显受到抑制(P<0.05).2μmol·L-1 PQQ可有效诱导细胞内ROS的产生,上调上皮钙黏蛋白的表达,下调波形蛋白和Snail的表达,抑制NF-κB活化水平(P<0.001).NAC可以减弱PQQ对EMT相关蛋白的调控作用,降低PQQ对NF-κB通路的抑制作用(P<0.01);PMA同样可以减弱PQQ对EMT相关蛋白的调控作用(P<0.05).结论 PQQ能够抑制CAL27细胞的EMT进程,ROS和NF-κB信号通路可能在该进程中发挥重要作用.