甲醇来源丰富、价格低廉,已成为生物制造行业极具吸引力的底物之一.构建微生物细胞工厂实现甲醇到增值化学品的生物转化,具有过程绿色、条件温和、产品体系多样等优势,不仅能拓展基于甲醇的产品链,还能缓解当前生物制造"与民争粮、与粮争地"的问题,是实现绿色生物制造的重要手段.因此,阐明不同天然甲基营养菌中涉及甲醇氧化、甲醛同化和异化途径对于后续基因工程改造工作至关重要,也更有利于构建新型非天然甲基营养菌.本文讨论了甲基营养菌中甲醇代谢途径的研究现状,并结合近年来天然和人工合成甲基营养菌在甲醇生物转化中的应用进展及面临的挑战.

酶催化CO2 还原制备高值化学品对缓解全球环境和能源危机具有重要意义,利用甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase,FDH)或多酶级联还原CO2 制备甲酸/甲醇具有选择性高、条件温和的优势,但关键酶活性低、稳定性差和重复利用率低的问题限制了其规模化应用,酶的固定化为这些问题提供了有效解决方案.本文总结了近年来利用膜、无机材料、金属有机框架和共价有机框架等载体对酶进行固定化的研究进展,阐释了不同固定材料和固定方式的特点和优势;进一步总结了固定化酶与电催化或光催化耦联反应体系对 CO2 还原的协同效果及应用,同时指出酶固定化技术和耦联反应体系目前存在的问题并对其发展前景进行了展望.

目的:建立六神曲的指纹图谱质控方法,比较鲜干品各组样品发酵前后槲皮苷、槲皮素、木犀草素等成分的变化状况.方法:经拆方研究,按前期优选的工艺制备六神曲基本组及鲜干品各组,分别为基本组、鲜品煎汁组、干品1/3量煎汁组及干品全量煎汁组,并于发酵前后取样检测.采用LC-MS检测,Ulitimate XB-C18色谱柱(4.6 mm× 250 mm,5μm),流动相甲醇-0.2％甲酸水溶液梯度洗脱,检测波长254 nm,电喷雾离子源(ESI),正离子模式检测.结果:确定鲜干品组方六神曲指纹图谱共有峰15个,其中10,13,15号峰分别为槲皮苷、木犀草素、槲皮素.基本组仅含木犀草素,发酵前后质量分数分别为18.5,21.3 μg·g-1,明显低于其他3组.在发酵前,鲜品煎汁组样品的3种成分含量均显著高于其他3组,与发酵前相比,发酵后木犀草素、槲皮素质量分数分别增长54.84％,4.53％;槲皮苷质量分数降低了0.76％.干品全量煎汁组发酵后3种成分含量较发酵前显著增加,其中槲皮苷、木犀草素、槲皮素质量分数分别增加了59.9％,161.7％,75.5％.结论:该质控检测方法精密、准确、重复性好,适用于六神曲的量化质量评价.发酵法可促进六神曲部分药效成分的溶出度增加及其生物转化反应的发生,初步揭示了六神曲发酵前后药效物质变化状况及鲜品入药优于干品的药效物质基础.

甲醇作为一种来源广泛、价格低廉、还原度高的非粮原料有望成为下一代生物制造的关键原料.利用合成生物学技术构建能够高效利用甲醇的重组微生物以实现从甲醇到高值化学品的生物转化已成国内外研究热点,但由于甲醇代谢过程的特殊性及复杂性,目前人工设计的甲基营养菌还难以实现以甲醇为唯一碳源进行生长及产物合成.基于对天然甲基营养菌甲醇代谢过程的分析,从甲醇脱氢酶的筛选与改造、甲醛同化途径的重构与优化、甲醇到化学品的生物转化几个方面对合成型甲基营养菌的构建策略及面临的挑战进行总结与分析,以期为今后合成型甲基营养菌的人工设计和利用提供一定的借鉴.

甲醇酵母由于独特优点被认为是绿色生物制造的潜在宿主.特别是其天然甲醇利用性能有望建立甲醇生物转化路线,拓展生物炼制底物,具有重要经济价值和环保意义.文中综述了代谢工程改造甲醇酵母合成蛋白质和化学品的最新研究进展,并比较了其与模式生物酿酒酵母作为细胞工厂的优缺点.随后,分析了甲醇酵母代谢工程改造面临的挑战,并展望了潜在解决方案.随着基因操作工具开发和细胞代谢阐释,甲醇酵母将在未来绿色生物制造发挥越来越重要的作用.

[背景]前期工作中筛选出一株产α-L-鼠李糖苷酶的细菌,经分子生物学方法鉴定为鸟肠球菌(Enterococcus avium).α-L-鼠李糖苷酶能够从天然类黄酮化合物中特异性切割末端鼠李糖,在食品生产、医药加工和化工等方面具有极大的开发前景和应用价值.[目的]克隆、表达鸟肠球菌中α-L-鼠李糖苷酶基因,进一步对重组蛋白的酶学性质进行研究.[方法]以鸟肠球菌(Enterococcus avium) strain 352基因组中推定的α-L-鼠李糖苷酶基因序列为基础,设计特异性引物扩增其编码区序列.以pET-28a(+)为载体构建重组表达质粒,将重组蛋白在Escherichia coli BL21 (DE3)感受态细胞中进行诱导表达.使用镍亲和层析纯化重组蛋白,以pNPR为底物测定重组蛋白的酶学性质.[结果]重组蛋白EaRha1分子量大小约为130 kDa.以pNPR为底物,EaRha1最适pH是7.0,最适温度为50℃,在pH 5.0-8.0稳定性较好,在40℃以下能保持较高酶活.金属离子对EaRha1有不同程度的促进或抑制作用.甲醇对EaRha1有抑制作用,并且抑制作用随着甲醇浓度的增大而增强.酶动力学常数Km和Vmax分别为0.35 mmol/L和4.2 μmol/(mg·min) (R2=0.999).EaRha1能催化水解新橙皮苷、柚皮苷和芦丁.[结论]通过对重组蛋白EaRha1酶学性质的研究,确定了该蛋白对黄酮类化合物的水解特性,为黄酮类化合物的生物转化奠定了理论基础.